على الطريقة مناعي لتوصيف خلايا المريء باريت

الهدف العام من التجربة التالية هو تقييم آثار العلاج الدوائي على بنية الخلية وتوطين البروتين في خلايا BE. يتم تحقيق ذلك عن طريق احتضان خلايا BE المزروعة على زلات الغطاء الزجاجي مع دواء مختار في ظروف زراعة الخلايا القياسية. كخطوة ثانية احتضان الخلايا المعالجة مع مثبت ، والذي يحافظ على بنية البروتين وتوطينها.

احتضان الخلايا الثابتة التالية بالتتابع مع الأجسام المضادة الثانوية الأولية وذات العلامات الفلورية من أجل تصور التغييرات في البروتين المستهدف المحدد عبر نتائج الفحص المجهري الفلوري التي توضح كيف أن العلاج الدوائي للخلايا be يغير توطين البروتين وبنية الخلية بناء على تصور تلطيخ الفلورسنت المناعي. على الرغم من أن هذه الطريقة يمكن أن توفر نظرة ثاقبة لمريء باريت ، إلا أنه يمكن تطبيقها أيضا على أنظمة أخرى بما في ذلك السرطان والخلايا الطبيعية. ابدأ هذا الإجراء بوضع زلات الغطاء مقاس 18 ملم في طبق بتري زجاجي وتعقيمها.

ثم انقل زلات غطاء الأوتوكلاف إلى طبق زراعة أنسجة 12 بئر باستخدام ماصة زجاجية معقمة متصلة بأنبوب مفرغ. بعد هذا الغسيل ، ينزلق الغطاء مع PBS معقم ووسائط. التربسين التالي.

الخلايا الخالدة بحساب الخلايا باستخدام عداد خلوي آلي أو مقياس خلوي hemo ، مما يخفف الخلايا في وسط الاستزراع إلى تركيز 20،000 إلى 40،000 خلية لكل مليلتر. ثم ضع ملليلترا واحدا من الخلايا في كل بئر يحتوي على زلة غطاء. للحصول على عدد إجمالي للخلايا من 20 ، 000 إلى 40 ، 000 خلية لكل بئر ، استخدم طرف ماصة معقمة لدفع زلة الغطاء برفق إلى قاع البئر للتأكد من أن الخلايا تلتصق بقلة الغطاء.

لعلاج خلايا BE ، قم بتخفيف الدواء المحدد في 37 درجة مئوية إلى مزيج التركيز المطلوب جيدا عن طريق قلب الأنبوب بشكل متكرر أو باستخدام خلاط دوامة. ابدأ العلاج بعد 24 ساعة من الجلوس الأولي لخلايا BE للسماح بربط الخلية بالغطاء ، وقم الآن بوضع علامات مسبقة على لوحات العينات المعالجة بالأدوية والمركبات باستخدام قلم مختبر للتمييز بين المقارنة والتحكم. عالج زلة غطاء إضافية من الخلايا مع 0.1٪ مركبة مخففة في الوسط ثقافة.

بعد ذلك ، ضع الخلايا في حاضنة زراعة الخلايا عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون و 98٪ رطوبة. الآن بعد وقت الحضانة المطلوب للعلاج بالمخدرات ، قم بشفط الوسائط واغسل الغطاء بسرعة باستخدام XPBS واحد في درجة حرارة الغرفة. ثم استنشق PBS وأضف ملليلتر واحد من PBS يحتوي على 4٪ PFA إلى كل بئر واحتضانه في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة.

بعد ذلك ، قم بشفط 4٪ P-F-A-P-B-S اغسل زلات الغطاء ثلاث مرات خمس دقائق في كل مرة باستخدام PBS في درجة حرارة الغرفة. قم بتخزين قسائم الغطاء لمدة أسبوع واحد في PBS و 0.1٪ PFA عند أربع درجات مئوية إذا رغبت في ذلك. لاختراق العيون لخلايا PFA الثابتة من أجل السماح للجسم المضاد بالوصول إلى الأهداف داخل الخلايا ، احتضان الخلايا بكلوريد الأمونيوم المخفف 50 ملليمولار في PBS لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.

ثم اغسلها بدرجة حرارة الغرفة PBS مرة واحدة لمدة خمس دقائق. سيؤدي ذلك إلى تقليل الخلفية لمنع الارتباط غير المحدد للأجسام المضادة بالبروتينات الخلوية. احتضان خلايا BE لمدة 30 دقيقة في 100 إلى 300 ميكرولتر من PBS تحتوي على 0.1٪ تروبونين و 0.5٪ BSA.

ثم قم بإعداد طبق اختبار حيوي مربع عن طريق وضع طبقات من قاع الغرفة بمنشفة ورقية مبللة ووضع طبقة من العطر في الأعلى. ضع علامة على العطر بقلم مختبر لتحديد زلات الغطاء. انقل خلايا الغطاء برفق المتجهة لأعلى على البارام باستخدام ملقط وإبرة حقنة.

الآن قم بتخفيف الجسم المضاد الأساسي في PBS الذي يحتوي على كل من 0.5٪ BSA و 0.1٪ سابونين لمسح محلول المنع برفق. باستخدام أنسجة المختبر ، أضف 100 ميكرولتر من محلول الجسم المضاد الأساسي واحتضان الخلايا بين عشية وضحاها عند أربع درجات مئوية. في اليوم التالي.

اغسل الشرائح ثلاث مرات باستخدام PBS الذي يحتوي على 0.5٪ BSA و 0.1٪ تروبونين لمدة خمس دقائق في كل مرة في درجة حرارة الغرفة. ثم قم بتخفيف الجسم المضاد الثانوي المترافق بعلامة فلورية في PBS تحتوي على 0.5٪ BSA و 0.1٪ ponent. أضف 100 ميكرولتر من الجسم المضاد المخفف إلى كل زلة غطاء واحتضان الخلايا لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة بعد ساعتين.

اغسل زلات الغطاء ثلاث مرات وخمس دقائق في كل مرة في PBS يحتوي على 0.5٪ BSA و 0.1٪ تروبونين. قم بإزالة مخزن الغسيل وأضف 100 إلى 300 ميكرولتر من PBS إلى زلات الغطاء. ارفع زلة الغطاء برفق باستخدام ملقط وامسح PBS باستخدام منديل مختبر أو منشفة ورقية.

ثم أضف 15 ميكرولترا من وسائط تركيب Antifa المناسبة التي تحتوي على DPI إلى زلة الغطاء. ضع زلة الغطاء المقلوبة على شريحة مجهر زجاجي بحيث تكون الخلايا متجهة لأسفل. بعد ذلك ، ضع الشرائح في مجلد شرائح واحتفظ بها بعيدا عن الضوء المباشر طوال الليل في درجة حرارة الغرفة للسماح لوسط أنتيفا بالشفاء.

بمجرد ضبط وسيط Antifa ، يمكن تخزين الشرائح إما عند أربع درجات مئوية أو سالب 20 درجة مئوية حتى التصور المجهري. في هذه الخطوة ، قم بإزالة شرائح التخزين من سالب 20 درجة مئوية أو أربع درجات مئوية واتركها تسخن إلى درجة حرارة الغرفة. قم بتشغيل المجهر ومصباح القوس الزئبقي.

ضع شريحة مجهرية مع توجيه زلة الغطاء نحو الهدف على مرحلة المجهر. بعد ذلك ، حدد مرشح DAPI وافتح الغالق. ركز الهدف أثناء النظر من خلال قطع العين حتى تظهر الصورة.

نظرا لأن جميع الخلايا ملطخة ب dpi ، يجب ملاحظة النوى بسهولة. تم جمع الصور باستخدام برنامج معالجة الصور المناسب في هذا الشكل ، حيث تمت معالجة زلات الغلاف مع CPC و CPD بمركبة أو ميكرومولار واحد من مثبط SRC. SKI 6 0 6 لمدة 24 ساعة تم تثبيت الخلايا ثم تلطخها.

وفقا للبروتوكول الموصوف ، تم تصور بيتا كاتينين المشار إليه باللون الأخضر باستخدام جسم مضاد محدد وجسم مضاد ثانوي مقترن ب LOR 4 88 بينما كانت النواة ملطخة ب DPI المشار إليه باللون الأزرق. لاحظ التغيير في موقع بيتا كاتينين من النواة إلى غشاء الخلية. بعد العلاج ب SKI 6 0 6.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية مناعة تلطيخ مريء باريت بالفلورسنت للتحقيق في توطين البروتين أو بنية الخلية.