إجراء بأحجام صغيرة للتركيز الفيروسي من المياه

الهدف العام من التجربة التالية هو تحسين استعادة الفيروسات من المياه باستخدام تقنية صغيرة الحجم صُممت في الأصل لتحسين تركيزات الفيروسات. وقد وُجد أن مرشح السليلوز الزجاجي هو أفضل مرشح موجب الشحنة كهربائياً لتركيز الفيروس الغدي (adenovirus) من المياه. وبالنسبة لعملية الشطف الثانوية، ثبت أن تقنية التركيز الثانوية باستخدام السليت (celite) هي الأفضل لشطف الفيروس الغدي من أسطح المرشحات. وتعمل التقنية الناتجة على استعادة أكبر قدر من الفيروس الغدي من مياه الصنبور، وذلك بناءً على تحقيق أعلى نسبة استعادة تم رصدها بين جميع تركيبات المرشحات وعمليات الشطف التي تم اختبارها.

تتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالطرق الحالية، مثل تركيز الأحجام الكبيرة، في أنها تستخدم أحجام عينات أصغر، مما يتيح تقييم العديد من متغيرات التركيز بسرعة وسهولة.

عند التحضير لهذا البروتوكول، جهز جميع المحاليل المطلوبة، بما في ذلك المحلول الفيروسي المفلتر بمرشح 0.22 micron بتركيز يتراوح من 10 إلى 100,000 MPN لكل ملليلتر.

ابدأ بقياس لتر واحد من مياه الصنبور المعقمة. انقلها إلى دورق سعة لترين يحتوي على قضيب تقليب مغناطيسي. وأثناء تقليب الماء، أضف 0.7 جرام من thiosulfate الصوديوم واتركها حتى تذوب تماماً. ثم اضبط قيمة pH لتكون بين 7 و7.5 عن طريق إضافة محاليل مخزنة من حمض أو قاعدة بتركيز مولار واحد قطرة تلو الأخرى. بعد ذلك، قم بتلقيح الماء بالفيروس. أضف ملليلتر كاملاً من محلول الفيروس المُحضّر. غطِّ الدورق بغطاء معقم واترك الفيروس يمتزج مع الماء لمدة 10 دقائق.

وفي هذه الأثناء، يتم تحضير مرشح Millipore. أولاً، قم بإخراجه من عبوته، وتأكد من إحكام تثبيته بين الوعاء العلوي والشبكة السفلية. بعد ذلك، تحقق من أن المادة الفلينية الموجودة على المرشح تتناسب تماماً مع حافة دورق ذو ذراع جانبية سعة لتر واحد. الآن، قم بإزالة الوعاء العلوي للمرشح واستخدم الملقط لوضع قرص ترشيح موجب الشحنة بقطر 47 ملم بشكل مستوٍ فوق شبكة الترشيح. ثم أعد تركيب الوعاء وثبته في مكانه عن طريق تدويره عكس اتجاه عقارب الساعة.

قم بقياس 100 milliliters من مياه الصنبور المطعمة باستخدام مخبار مدرج معقم. ثم انقل المياه إلى بيت المرشح المُجهز في القارورة سعة two liter. قد يكون القرص موجب الشحنة الكهربائية في المرشح عبارة عن زجاج-سليلوز مطوي أو ألياف زجاجية من نانو-الألومينا. يمكن استخدام تفريغ هوائي خفيف لتمرير المياه المتبقية عبر المرشح.

الآن، انقل مبيت المرشح إلى دورق جانبي سعة 250 milliliter. قم بقياس 100 milliliters من مستخلص اللحم واسكبه ببطء فوق المرشح. اترك المستخلص يمر ببطء واستخدم تفريغاً هوائياً خفيفاً لسحب الرواسب المتبقية.

ثم انتقل إلى أي من خياري التركيز الثانوي المتاحين.

لتركيز الفيروس باستخدام السليت (celite)، انقل محتوى الدورق سعة 250 مل، والذي يحتوي على الفيروس، إلى جهاز تحريك مغناطيسي. وباستخدام قضيب تحريك، كوّن دوامة صغيرة. بعد ذلك، أضف 0.1 جرام من مسحوق السليت إلى 100 مل من مستخلص لحم البقر. اترك السليت يتشتت واستعد لضبط الرقم الهيدروجيني (pH) للمحاليل. وباستخدام إضافات قطارة من حمض الهيدروكلوريك بتركيز 0.1 مولار، خفض pH إلى 4.0.

بعد ذلك، اترك المحلول يمتزج لمدة 10 دقائق. وأثناء عملية المزج، قم بتثبيت المرشح المسبق سعة 47 مليلتر على دورق سعة لترين. الآن، صب 100 مليلتر من خليط مستخلص اللحم و-celite عبر المرشح المسبق. يمكن استخدام تفريغ بسيط لإنهاء العملية.

ضع بعد ذلك مشبك أنبوب معدني على نهاية فوهة مبيت المرشح. ثبّت في المشبك أنبوب تجميع معقم من البولي بروبيلين سعة 15 milliliter، ثم أعد تركيب المرشح على الدورق.

الآن قم باستخلاص الفيروس من جزيئات Celite باستخدام خمسة مللي لتر من 1X PBS عند pH 9. اترك معظم محلول PBS يتسرب عبر الجاذبية إلى أنبوب سعة 15 مللي لتر، ثم اسحب الكمية المتبقية باستخدام تفريغ هوائي خفيف. لتركيز الفيروس باستخدام التلبيد العضوي، انقل محتويات دورق سعة 250 مللي لتر الذي يحتوي على الفيروس إلى لوح تحريك مغناطيسي. وباستخدام قضيب تحريك، قم بإنشاء دوامة صغيرة. اضبط pH المحلول إلى 3.5 عن طريق إضافة حمض الهيدروكلوريك بتركيز 1 M قطرة تلو الأخرى. ثم اترك الخليط يستمر في التحريك لمدة نصف ساعة. لاحقاً، انقل المحلول إلى أنبوب طرد مركزي مخروطي معقم سعة 250 مللي لتر. قم بتركيز المحلول عن طريق الطرد المركزي عند 2,500 g لمدة 15 دقيقة عند درجة حرارة 4 °C. بعد عملية الطرد، توخَّ الحذر لعدم تشتيت الراسب عند التعامل مع الأنابيب. قم بسحب السائل الطافي بعناية وأعد تعليق الراسب في خمسة مللي لتر من PBS pH 9. تأكد من ذوبان الراسب تماماً. ثم قم بطرد إعادة التعليق مركزياً عند 4,000 g لمدة 10 دقائق عند درجة حرارة 4 °C. الآن اجمع السائل الطافي الذي يحتوي على الفيروس المركز. يمكن التخلص من الراسب.

عند تحسين هذا البروتوكول، تمت مقارنة ثلاثة أنواع من السيليت. وقد أدى استخدام السيليت ذو الحبيبات الأكبر إلى انخفاض معدلات استعادة كل من ADV 40 و ADV 41.

تم اختبار شطف المرشح عند قيمة pH تتراوح بين 7.5 و 12 لتحديد القيمة الأكثر فعالية في تجميع جزيئات ADV من المرشحات. وقد تم الحصول على أعلى نسبة استعادة من مرشح زجاجي-سليلوزي مقترن بمستخلص لحم البقر عند pH 10 ومع السليت. وكانت النتيجة نفسها مع ADV 40 و ADV 41.

ثبت أن مستخلص لحم البقر عند pH 10 يتفوق على التنديف العضوي.

تمت مقارنة الطريقة المُحسّنة مع إضافة 25% من التريبسين، وكذا مع تدعيم مستخلص اللحم بـ 0.1% من بولي فوسفات الصوديوم. ولم تؤدِ أي من هاتين المعالجتين إلى تحسين استعادة ADV بشكل ملحوظ.

بمجرد إتقان هذه التقنية، يمكن تنفيذها في غضون 45 دقيقة إذا تم تطبيقها بشكل صحيح.