محلل خلية مقرها الممانعة الحقيقي في الوقت كأداة لتحديد المسارات الجزيئية تشارك في العصبية والحمايه العصبيه في خط الخلية العصبية

الهدف العام من هذا الإجراء هو استخدام تقنية تعتمد على الممانعة لمتابعة الحماية الخلوية في الوقت الفعلي لسلالة من الخلايا العصبية، وذلك لتحديد مدى مشاركة مسارات الرسل الثانية في عملية الحماية. يتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق زراعة سلالة من الخلايا العصبية في ظروف تكاثرية داخل محلل خلايا في الوقت الفعلي يعتمد على الممانعة. وفي الخطوة الثانية، يتم استخدام عوامل قد تكون ذات صلة.

يتم تثبيط مسارات الرسل الثانية دوائيًا قبل إخضاع الخط الخلوي لمعالجات الحماية العصبية. بعد ذلك، يتم تتبع حالة الخط الخلوي العصبي باستخدام محلل خلايا في الوقت الفعلي تحت الظروف التجريبية المختلفة. وفي النهاية، يمكن استخدام التحليل الإحصائي لتقييم مشاركة مسارات الرسل الثانية في الوقت الفعلي في الحماية الخلوية للخلايا العصبية.

تكمن الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالطرق الحالية، مثل فحوصات السمية العصبية النهائية، في أنها تتيح تقييم الحماية من التيتو والسمية التيتوية في الخطوط الخلوية العصبية في الوقت الفعلي وتحت ظروف خالية من الوسوم. يمكن لهذه الطريقة أن تساعد في الإجابة على تساؤلات سريعة في مجال البيولوجيا العصبية الجزيئية من خلال المساهمة في تقييمات ذات إنتاجية أعلى للمركبات ذات القدرة على الحماية العصبية في المختبر، ومن خلال توفير رؤى حول الآليات الجزيئية المشاركة في الحماية العصبية. ابدأ بغسل طبقة من خط خلوي عصبي ملتصق؛ على سبيل المثال، تُستخدم هنا خلايا الورم الأرومي العصبي البشري S-K-N-S-H مع PBS، ثم تُعالج الخلايا بالتريبسين لمدة خمس دقائق عند 37 °C.

قم بإزالة التربسين عن طريق الطرد المركزي ثم أعد تعليق الخلايا في 10 milliliters من وسط التكاثر. بعد عد الخلايا، خفف تركيز الخلايا إلى 3 × 10⁵ خلية لكل milliliter باستخدام المزيد من وسط التكاثر، ثم قم بموازنة كل بئر من أطباق EPL 96 بإضافة 100 microliters من وسط التكاثر داخل غطاء زراعة الأنسجة في درجة حرارة الغرفة. بعد 30 دقيقة، أدخل أطباق EPL 96 في محطة تحليل الخلايا في الوقت الحقيقي داخل حضانة ثاني أكسيد الكربون عند 37 °C وقم بتشغيل برنامج تحليل الخلايا في الوقت الحقيقي.

بعد ذلك، في صفحة المخطط (layout page)، حدد الآبار المناسبة للتجربة، ثم أدخل نوع الخلايا وعددها وأسماء وتركيزات المركبات الكيميائية المطلوبة في مربعات التحرير الموجودة في صفحة برنامج الجدولة، حيث تكون الخطوة الأولى معدة مسبقاً. وبالنسبة لقياس الخلفية، اختر "إضافة خطوة" (add a step) واضبط الخطوة الثانية لقياس مؤشر الخلايا (cell index) كل 15 دقيقة لمدة 96 ساعة. ثم انقر فوق "بدء" (start) لتفعيل الخطوة الأولى، ولقياس معاوقة الخلفية (background impedance) للوسط الغذائي.

قم الآن بإزالة الـ EPL وإضافة 100 µL من معلق خلايا الورم الأرومي العصبي. قم بتدوير الـ EPL 96 بلطف في كل بئر تجريبي لتغطية الآبار بشكل متساوٍ، ثم حضن الطبق في درجة حرارة الغرفة داخل غطاء زراعة الأنسجة للسماح للخلايا بالاستقرار. بعد نصف ساعة، قم بتحميل الـ EPL 96 مرة أخرى في محطة تحليل الخلايا في الوقت الفعلي وابدأ الخطوة الثانية. لمراقبة قيم مؤشر الخلايا طوال التجربة، استعرض منحنيات الخلايا في صفحة المخطط وبيانات مؤشر الخلايا الخام في صفحة مؤشر الخلايا لمدة 24 ساعة.

بعد زراعة الخلايا في الأطباق، أوقف التجربة وقم بإزالة الطبق من محطة تحليل الخلايا في الوقت الفعلي. وزع ميكرولتر واحد من المثبطات المراد دراستها والمخففة حديثاً في كل بئر، ثم بعد إعادة تحميل جهاز EPL 96، استأنف قياسات مؤشر الخلايا التجريبية بعد 30 دقيقة، وأوقف التجربة مرة أخرى وقم بإزالة وسط التكاثر من كل بئر بسرعة وبحذر، مع توجيه حافة رأس الماصة نحو زاوية البئر لتجنب تعطيل طبقة الخلايا الملتصقة. بعد ذلك، أضف فوراً 200 ميكرولتر من وسط الحرمان من المصل إلى كل بئر، وميكرولتر واحد من المركبات الواقية للأعصاب المراد دراستها والمخففة حديثاً، وميكرولتر واحد من مثبطات مسار الرسل الثانية المراد دراستها في الآبار المناسبة.

ثم استمر في قياسات مؤشر الخلايا (cell index) كل 15 دقيقة لمدة 96 ساعة كما تم ضبطه مسبقاً؛ ولتحليل البيانات، اختر الآن وظائف مؤشر الخلايا المعياري (normalized cell index) والوقت المعياري (normalized time) في صفحة الرسم البياني لتعيير مؤشر الخلايا بالنسبة لآخر نقطة زمنية قبل إجراء التعديلات على المزرعة الخلوية، وذلك لتقليل التباين بين التجارب. حدد الآبار في صفحة الرسم البياني الخاصة بظروف التجربة المطلوبة، ثم انقر على "إضافة" (add) لرسم منحنيات مؤشر الخلايا المعياري.

بعد ذلك، قم بتصدير البيانات التجريبية لجميع النقاط الزمنية لمؤشر الخلايا من صفحة برنامج مؤشر الخلايا إلى ملف جدول بيانات لإجراء التحليل الإحصائي للاختلافات في قيم مؤشر الخلايا تحت ظروف المعالجة المختلفة في نقاط زمنية محددة. اختر قيم مؤشر الخلايا في نقاطها الزمنية المقابلة داخل ملف جدول البيانات المُصدّر. وأخيراً، قم بتحليل قيم مؤشر الخلايا للنقاط الزمنية المختارة باستخدام تحليل التباين أحادي أو ثنائي الاتجاه، يليه اختبار بعدي باستخدام برنامج إحصائي. تؤدي المنبهات السمية العصبية للخلايا إلى انخفاض في قيم مؤشر الخلايا؛ تظهر هذه الرسوم البيانية زيادة في مؤشر الخلايا عند تنمية خلايا S-K-N-S-H في وسط تكاثري، يليها انخفاض في مؤشر الخلايا ثم استقراره عند مستويات أدنى جديدة بعد نقل الخلايا إلى وسط حرمان من المصل.

يمكن ملاحظة التأثير الواقي للأعصاب لكل من ناهضَي مستقبل السيروتونين 2أ بتركيز 5 µM من DOI و20 µM من IDE عند إضافتهما إلى الخلايا المغذاة بوسطات خالية من المصل. ويبرز هنا تساؤل هام في دراسات الحماية العصبية حول ما إذا كان التأثير على تكاثر الخلايا يساهم في التأثير الملاحظ للمركب على بقاء الخلية. ويظهر هذا الرسم البياني عدم وجود تأثير لمعالجة خلايا SKNS بتركيز 5 µM من DOI على تكاثرها، مما يشير إلى أن التكاثر لا يساهم في التأثير الواقي للأعصاب الملاحظ.

في هذا الرسم البياني النهائي، يمكن ملاحظة تأثير المعالجة بـ 10 micromolar من مثبط إنزيم phosphatidyl inositol three kinase المسمى LY 2 9 4 0 0 2 على بقاء الخلايا، والتأثير الوقائي العصبي لـ DOI على خلايا SK NSH المحرومة من المصل. لقد منع LY 2 9 4 0 0 2 التأثير الوقائي العصبي لـ DOI خلال مرحلة الحرمان من المصل، ولكنه أظهر أيضاً بعض التأثيرات السامة الخاصة به. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تتبع الحماية من CTO في خط خلايا عصبية باستخدام محلل خلايا في الوقت الحقيقي، وتحديد دور مسارات الرسل الثانية في هذه الحماية.