محلل خلية مقرها الممانعة الحقيقي في الوقت كأداة لتحديد المسارات الجزيئية تشارك في العصبية والحمايه العصبيه في خط الخلية العصبية

الهدف العام من هذا الإجراء هو استخدام تقنية قائمة على المعاوقة لمتابعة حماية cyto في الوقت الفعلي لخط الخلايا العصبية لتحديد مشاركة مسارات الرسول الثاني في عملية الحماية. يتم تحقيق ذلك عن طريق زراعة خط الخلايا العصبية أولا في ظل ظروف تكاثرية في محلل خلية في الوقت الفعلي قائم على المقاومة. في الخطوة الثانية ، يحتمل أن يكون ذا صلة.

يتم تثبيط مسارات الرسول الثانية دوائيا قبل إخضاع خط الخلية لعلاجات واقية من الأعصاب. بعد ذلك ، تتم متابعة حالة خط الخلايا العصبية باستخدام محلل خلية في الوقت الفعلي في ظل الظروف التجريبية المختلفة. في النهاية ، يمكن استخدام التحليل الإحصائي لتقييم المشاركة في الوقت الفعلي لمسارات الرسول الثاني في حماية السيتو للخلايا العصبية.

الميزة الرئيسية لهذه التقنية على الطرق الحالية مثل فحوصات السمية العصبية لنقطة النهاية ، هي أنها تسمح بتقييم حماية تيتو وسمية التيتو في خطوط الخلايا العصبية في الوقت الفعلي وفي ظل ظروف خالية من الملصقات. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة السريعة في مجال البيولوجيا العصبية الجزيئية من خلال المساهمة في تقييم الإنتاجية العالية للمركبات الواقية العصبية المحتملة في المختبر ، ومن خلال توفير نظرة ثاقبة للآليات الجزيئية المشاركة في الحماية العصبية ابدأ بغسل طبقة خط الخلايا العصبية الملتصقة. على سبيل المثال هنا ، يتم استخدام خلايا الورم الأرومي العصبي البشري S-K-N-S-H مع PBS ثم التربسين للخلايا لمدة خمس دقائق عند 37 درجة مئوية.

قم بإزالة التربسين عن طريق الطرد المركزي ثم أعد تعليق الخلايا في 10 ملليلتر من وسط التكاثر. بعد عد الخلايا ، قم بتخفيف الخلايا إلى ثلاثة أضعاف 10 إلى الخلايا الخامسة لكل تركيز مليلتر مع وسط انتشار أكثر ، ثم قم بموازنة كل بئر من EPL 96 مع 100 ميكرولتر من وسط التكاثر في غطاء مزرعة الأنسجة في درجة حرارة الغرفة. بعد 30 دقيقة ، أدخل EPL 96 في محطة محلل الخلايا في الوقت الفعلي في حاضنة ثاني أكسيد الكربون عند 37 درجة مئوية وابدأ تشغيل برنامج محلل الخلايا في الوقت الفعلي.

ثم في صفحة التخطيط ، حدد الآبار المناسبة للتجربة وأدخل رقم خلية نوع الخلية وأسماء وتركيزات المركبات الكيميائية ذات الأهمية في مربعات التحرير في صفحة برنامج الجدولة حيث يتم ضبط الخطوة الأولى مسبقا. لقياس الخلفية، حدد إضافة خطوة وقم بتعيين الخطوة الثانية لقياس فهرس الخلية كل 15 دقيقة لمدة 96 ساعة. ثم انقر فوق ابدأ لبدء الخطوة الأولى ، ولقياس مقاومة خلفية الوسائط.

الآن قم بإزالة EPL وأضف 100 ميكرولتر من تعليق خلايا الورم الأرومي العصبي. لكل بئر تجريبي ، قم بتدوير EPL 96 برفق لتغطية الآبار بالتساوي ، ثم احتضان اللوحة في درجة حرارة الغرفة في غطاء مزرعة الأنسجة للسماح للخلايا بالاستقرار بعد نصف ساعة ، وقم بتحميل EPL 96 مرة أخرى في محطة محلل الخلية في الوقت الفعلي وابدأ الخطوة الثانية. لمراقبة قيم فهرس الخلية طوال التجربة ، اعرض منحنيات الخلية على صفحة المخطط وبيانات فهرس الخلية الأولية على صفحة فهرس الخلية على مدار 24 ساعة.

بعد طلاء الخلايا ، أوقف التجربة مؤقتا وقم بإزالة اللوحة من محطة محلل الخلية في الوقت الفعلي. قم بتوزيع ميكرولتر واحد من مثبطات الاهتمام المخففة حديثا في كل بئر ، ثم بعد إعادة تحميل EPL 96 ، استأنف قياسات مؤشر الخلية التجريبية بعد 30 دقيقة ، وأوقف التجربة مؤقتا مرة أخرى وقم بإزالة وسط التكاثر بسرعة ولكن بعناية من كل بئر ، وتوجيه حافة طرف الماصة إلى زاوية البئر لتجنب تعطيل طبقة الخلية الملتصقة. ثم أضف على الفور 200 ميكرولتر من وسط الحرمان من المصل إلى كل بئر ، وميكرولتر واحد من مركبات الحماية العصبية المخففة حديثا ذات الأهمية ، وميكرولتر واحد من مثبطات مسار الرسول الثاني ذات الأهمية للآبار المناسبة.

ثم تابع قياسات فهرس الخلية كل 15 دقيقة لمدة 96 ساعة كما تم تعيينه مسبقا لتحليل البيانات ، والآن حدد فهرس الخلية الطبيعي ووظائف الوقت الطبيعي على صفحة المؤامرة لتطبيع فهرس الخلية إلى آخر نقطة زمنية قبل التعديلات على ثقافة الخلية. لتقليل التباين بين التجارب. قم بتمييز الآبار في صفحة المؤامرة للظروف التجريبية ذات الاهتمام وانقر فوق إضافة لرسم منحنيات فهرس الخلية الطبيعية.

ثم قم بتصدير البيانات التجريبية لجميع النقاط الزمنية لفهرس الخلية من صفحة برنامج فهرس الخلية إلى ملف جدول بيانات للتحليل الإحصائي للاختلافات في قيم فهرس الخلية في ظل ظروف المعالجة المختلفة في نقاط زمنية محددة. حدد قيم فهرس الخلايا في النقاط الزمنية الخاصة بها داخل ملف جدول البيانات الذي تم تصديره. أخيرا ، قم بتحليل قيم فهرس الخلية للنقاط الزمنية المحددة من خلال تحليل واحد أو اتجاهين للتباين ، متبوعا باختبار لاحق باستخدام محفزات سامة للأعصاب للبرامج الإحصائية للخلايا تؤدي إلى انخفاض في قيم فهرس الخلية هنا زيادة في مؤشر الخلية عندما تنمو خلايا S-K-N-S-H في وسط التكاثر وانخفاض مؤشر الخلية متبوعا باستقرار عند المستويات الدنيا الجديدة بعد ذلك يظهر تحويل الخلايا إلى وسط الحرمان من المصل في هذه الرسوم البيانية.

التأثير العصبي لاثنين من السيروتونين اثنين من ناهضات مستقبلات خمسة ميكرومولار ، DOI و 20 ميكرومولار IDE المضافة عندما تم تغذية الخلايا بالحرمان من المصل ، يمكن ملاحظة المتوسط. سؤال مهم في دراسات الحماية العصبية هو ما إذا كان التأثير على تكاثر الخلايا يساهم في التأثير المركب المرصود على بقاء الخلية. في هذا الرسم البياني ، يظهر عدم وجود تأثير لعلاج DOI الخمسة ميكرومولار على تكاثر خلايا SKNS مما يشير إلى أن التكاثر لا يساهم في التأثير العصبي المرصود.

في هذا الرسم البياني النهائي ، يمكن ملاحظة تأثير العلاج ب 10 ميكرومولار من مثبطات كيناز الفوسفاتيديل الأولية الثلاثة LY 2 9 4 0 0 2 على بقاء الخلايا والتأثير الوقائي العصبي ل DOI على خلايا SK NSH المحرومة من المصل. منع LY 2 9 4 0 0 2 التأثير العصبي ل DOI خلال مرحلة الحرمان من المصل ، ولكنه أظهر أيضا بعض التأثير السام الخاص به. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية اتباع حماية CTO في خط الخلايا العصبية باستخدام محلل الخلايا في الوقت الفعلي ، وتحديد مشاركة مسارات المراسلة الثانية في الحماية.