تسجيلات في وقت واحد على المدى الطويل في مرحلتين العصبية في معالجة يتصرفون نحل العسل
July 21st, 2014
أنشئت التسجيلات المدى الطويل خارج الخلية في وقت واحد من اثنين neuropiles الدماغ المختلفة أو اثنين مساحات تشريحية مختلفة في نحل العسل. تسمح هذه التسجيلات التحقيق في الجوانب الزمنية للتجهيز الخلايا العصبية في مناطق الدماغ المختلفة في الخلايا العصبية واحد، وكذلك على مستوى الفرقة في حيوان يتصرف.
الهدف العام من هذا الإجراء هو دراسة الطلاء الشمي وتكوين الذاكرة باستخدام الوصول طويل الأمد إلى مرحلتين مستقلتين لمعالجة الخلايا العصبية داخل نحل العسل الذي يتصرف. يتم تحقيق ذلك عن طريق تجميع أقطاب كهربائية متعددة القنوات منخفضة التكلفة أولا من الأسلاك النحاسية الصغيرة المعزولة والحوامل المصنوعة حسب الطلب. الخطوة التالية هي تحضير نحل عسل حي عن طريق إزالة جزء من كبسولة رأسه لإدخال قطبين كهربائيين معالجين بصبغة فلورية في الدماغ المكشوف.
الخطوة الثالثة هي التسجيل من حبوب منع الحمل العصبية المستقلة أو المسالك في المسار الشمي ، مع التحفيز برائحة الأزهار والفيرومونات. في وقت لاحق ، بعد تشريح الدماغ ، يتم حقن متتبع فلورسنت مختلف في فص الهوائي لردم الخلايا العصبية المستهدفة. ثم يتم تصور المسارات المملوءة وتتبع الأقطاب الكهربائية لإنتاج إعادة بناء ثلاثية الأبعاد للبنية العصبية.
في النهاية ، يمكن فهم العلاقات في طلاء الرائحة بين مجموعتي الخلايا العصبية على مستويات معالجة مختلفة مثل فص الهوائي وجسم الفطر بشكل أفضل باستخدام هذه التقنيات. لذا فإن المزايا الرئيسية لهذه التقنية للطرق الحالية هي أن أقطاب كهربائية متعددة القنوات صغيرة جدا ويمكن استخدامها معا ، مما يعني أنه يمكننا التسجيل في وقت واحد في مناطق مختلفة من الدماغ بعد تثبيتها. تسمح الأسلاك المرنة باستدعاء مستقر لعدة ساعات في تصرف.
يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال علم الأمراض العصبية ، مثل فهم كيفية تلقي ومصانع olf في الحياة من بيئتها وإدراكها وحسابها في النهاية. يمكن أن توفر تقنية التسجيل المزدوج هذه نظرة ثاقبة للآلية الأساسية لترميز الرائحة والشبكات العصبية بشكل عام. يمكن أيضا تطبيقه على الكائنات الحية النموذجية الأخرى في اللافقاريات أو المودة وعلم الأعصاب.
بشكل عام ، سيكافح الأفراد الجدد في هذه الطريقة لأن الكثير من التدريب ضروري لتحديد الخلايا العصبية لنحل العسل باستخدام المعالم المورفولوجية فقط مثل الفص الداخلي أو الفص الرأسي لجسم الفطر. بالنسبة لهذا البروتوكول ، قم ببناء محول قطب كهربائي ليناسب لوحة واجهة قطب كهربائي قياسية. أولا ، قم بلحام ثلاث قطع قصيرة من الأسلاك المعزولة بموصل 18 سنا.
ثم قم بقص قطعة من لوح زجاج شبكي وأدخل أخدودا ضحلا على طول الجانب الأطول. بعد ذلك ، قم بربط عروات اللحام في لوحة زجاج شبكي وقم بلصق اللوحة على الجزء العلوي من الموصل. ثم قم بتوصيل القاعدة بالعروات باستخدام الأسلاك الثلاثة القصيرة.
بعد ذلك ، ضع الشعيرات الدموية الزجاجية في أخدود لوحة زجاج شبكي. يجب أن تكون الشعيرات الدموية قادرة على الانزلاق وتثبيتها بواسطة المسمار باستخدام دبوس صغير ، قم بتمديد الشعيرات الدموية الزجاجية للخارج حوالي خمسة ملليمترات. سيتم استخدام الشعيرات الدموية والدبوس لدعم وتثبيت الأسلاك الدقيقة للقطب الكهربائي.
بعد ذلك ، ضع ثلاثة أسلاك دقيقة. بمساعدة شريط لاصق للوصول بشكل أفضل ، يمكن إزالة الشعيرات الدموية الزجاجية باستخدام غراء إبرة لحام 12 فولت. الأسلاك مع شمع الأسنان LMP لا تلصق الثلث الأخير من الأسلاك.
الآن قم بتوصيل مجموعة الأسلاك الصغيرة متعددة القنوات بمحول القطب. ضع الشعيرات الدموية الزجاجية الممتدة بالتوازي مع الأسلاك الدقيقة. قم بتأمين هذا المرفق بشمع الأسنان على طول الشعيرات الدموية الزجاجية المتداخلة والدبوس الدقيق.
ثم قم بقص أسلاك القطب الكهربائي مع ترك سنتيمترين إلى ثلاثة سنتيمترات تمتد من الدبوس الدقيق وسنتيمترين إلى ثلاثة سنتيمترات تمتد من نهاية القطب. بعد ذلك ، قم بتأمين الشعيرات الدموية في محول القطب الكهربائي واستخدم برغيا لتثبيت كل شيء في مكانه. عند 360 درجة مئوية.
لحام نهايات الأسلاك بشكل عمودي على العروات. ثم تحقق من وجود اتصال كهربائي قوي بما فيه الكفاية عن طريق التحقق من أن مقاومتهما تبلغ حوالي 300 كيلو أوم عند كيلو هرتز واحد. الآن قم بتوصيل قنوات محول القطب الثاني بالقطب الرئيسي ولحام الأقطاب المرجعية والعضلية بقاعدة الأقطاب الكهربائية الرئيسية.
أخيرا ، قم بتركيب القطب الرئيسي على لوحة واجهة مرحلة الرأس. قم بتثبيت القطب الثاني على محول منفصل بعد الحصول على نحل العسل يبرد واحدا على الجليد حتى يتم تجميده. بعد ذلك ، قم بإصلاح النحلة في حامل زجاج شبكي قياسي مع كشف الرأس.
ضع شمع الأسنان الساخن على قاعدة العينين والتقاطع بين الرأس والصدر ، وبالتالي تأمين الرأس. استمر في استخدام الشمع لشل حركة العين السكيب للهوائيات على كبسولة الرأس. تجنب وضع الشمع على الفاجل ، والذي يحتاج إلى الإشارة إلى الأمام.
يجب أن يكون Pro Bois خاليا من الاصطدام. تأكد من أنه يمكن أن يتحرك. الآن احلق كبسولة الرأس لتحسين إمكانية الوصول.
ثم قم بإطعام النحلة كل 30٪ من السكروز الذي ستستهلكه. هذا يضمن التحضير الجيد والجدوى ورطوبة الأنسجة. الآن باستخدام مشرط صغير ، قم بقصه عموديا على طول حدود العين وأفقيا فوق قواعد الهوائي.
استمر في القطع تحت عين الخلية O وإزالة بشرة فضفاضة. يجب تحريك الغدد البلعومية جانبا، وكذلك القصبة الهوائية. سيؤدي ذلك إلى تمهيئ الطريق لإدخال القطب.
ابدأ بإدخال القطب المرجعي ، وهو سلك فضي 35 ميكرون. أولا ، قم بعمل قطع صغير في العين المركبة المماثلة. ثم دس القطب من خلاله.
بعد ذلك ، أدخل السلك الثاني في منطقة إسقاط العضلات أسفل عين الخلية O الجانبية. لتصور مواضع الأقطاب الكهربائية لاحقا ، اغمس الأقطاب الكهربائية في محلول 0.5 مولار كلوريد البوتاسيوم ، و 5٪ Alexa Hydrocyte 4 88 لمدة ثلاث دقائق. بعد ذلك ، باستخدام معالجات دقيقة ، ضع القطبين في الدماغ.
وجه نفسك من خلال تحديد شص الهوائي والفص الرأسي لجسم الفطر. هنا يوجد قطب كهربائي واحد في مسلك فص الهوائي الجانبي بعمق 180 ميكرون والآخر في جهاز شحمة الهوائي الإنسي. تم إدخاله بعمق حوالي 300 ميكرون.
أكمل مواضع الأقطاب الكهربائية عن طريق تثبيتها باستخدام مكونين. يغطي السيليكون المساحة الكاملة فوق الدماغ ، مما يمنع الأنسجة أيضا من الجفاف. ثم تابع إجراء التسجيلات لاستخراج نشاط الوحدة من الإشارة المسجلة خارج الخلية.
استخدم برنامج فرز السنبلة المتاح. استخدم قنوات الأقطاب الكهربائية المتمايزة. قم بتطبيق تقنيات مطابقة القوالب في وقت واحد على جميع قنوات الأقطاب الكهربائية الثلاثة لاكتشاف مجموعات الأشكال الموجية المختلفة التي تمثل أحداث الارتفاع الفردي.
وأخيرا ، التحكم في الفصل المناسب للوحدة. استخدام تحليل المكونات الأساسية على أحداث السنبلة الفردية لقنوات القطب الكهربائي المتمايزة الثلاث المسجلة. بعد إجراء التسجيلات ، قم بإزالة السيليكون والأقطاب الكهربائية بعناية من النحلة.
بعد ذلك ، اشطف الدماغ بمحلول رنين النحل وقم بإزالة الغدد والقصبة الهوائية. ثم باستخدام ماصة دقيقة يتم حقنها في فص الهوائي ، يتم إذابة 5٪ من الياقوت الصغير في أسيتات بوتاسيوم مولارية واحدة. سيوفر هذا تسمية أمامية لمسارات الفص.
من الآن فصاعدا ، قم بتنفيذ جميع الخطوات في أقصى درجات الظلام. اشطف الدماغ باستخدام رنين النحل مرة أخرى ، ثلاث مرات ، واترك الصبغة تحتضن لمدة 30 إلى 45 دقيقة. شل حركة النحلة عن طريق تبريدها في الثلاجة.
ثم عزل الدماغ. إصلاح الدماغ في 4٪ بارا ألدهيد في 0.1 مولار PBS بين عشية وضحاها عند أربع درجات مئوية وبتحريض لطيف. اتبع ذلك مع البروتوكولات القياسية للجفاف والتطهير بعد إعادة ملء الخلايا العصبية الإسقاط في فص الهوائي باستخدام متتبع الياقوت الصغير ، تم تجميع عرض إسقاط لهذه الخلايا العصبية من شرائح أورثو على طول المحور Z.
تظهر صبغة Alexa Hydrocyte 4 88 على القطبين إدخالهما في فص الهوائي الإنسي ، وفي جهاز فص الهوائي الجانبي. تم استخدام إعادة بناء ثلاثية الأبعاد للخلايا المستهدفة الملطخة ومواقع إدخال القطب الكهربائي لعمل تخطيطي للمسارين المشبعين لفص الهوائي ، والتسجيل المتزامن من مسالك فص الهوائي مع تحفيز النحلة بتركيزات مختلفة من الرائحة ، تم استخدامها للتحقيق في المعالجة الزمنية. تم تقييم النشاط في مراحل المعالجة اللاحقة.
يوضح تحليل المكونات العصبية لإسقاط شص شص الهوائي وتحليل مكون مبدأ الخلايا العصبية الخارجية لنواقل السكان أن الرائحة في الخلايا العصبية الإسقاط كانت طويلة وتجاوزت المنبه. على النقيض من ذلك ، في مجموعة الخلايا العصبية الخارجية ، تم تمثيل أنواع الرائحة والرائحة فقط. لذلك عند عرض النشاط بمرور الوقت ، تظهر مجموعة الخلايا العصبية الخارجية الموجودة على اليمين نشاط فصل الرائحة قبل أن تبدأ مجموعة الخلايا العصبية الإسقاط في تطوير نشاطها الناجم عن الرائحة.
يتمتمييز تحفيز الرائحة باللون الرمادي. بمجرد إتقانها ، يستغرق الأمر حوالي 30 دقيقة لبناء قطب. يمكن تحضير النحلة وإدخال الأقطاب الكهربائية في المناطق المستهدفة في غضون نصف ساعة أخرى إذا تم إجراؤها بشكل صحيح.
أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر أن كل خطوة تتطلب الكثير من الممارسة والصبر حتى يتم إتقانه. كن حذرا بشكل خاص عند رفع أسلاك القطب الكهربائي إلى نقاط الاتصال الخاصة بها والتسجيل من متناول الدماغ المطلوب. المعرفة القوية المطلوبة لتشريح دماغ نحل العسل بعد تطوره.
مكنت هذه التقنية الباحثين في مجال علم الأمراض العصبية وشم الحشرات من استكشاف العلاقات الزمنية الدقيقة بين نشاط المسارات العصبية المختلفة ومراكز الدماغ في سلوك نحل العسل. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية بناء واستخدام أقطاب كهربائية متعددة القنوات من الأسلاك الدقيقة للتسجيل في وقت واحد من منطقتين من الدماغ وتصرفات نحل العسل. يجب أن تكون قادرا أيضا على تصور المواقع الدقيقة لأقطاب التسجيل الخاصة بك.
النظرة العامة
تقدم هذه الدراسة طريقة لتسجيلات خارج الخلية طويلة الأمد المتزامنة من شبكتين عصبيتين مختلفتين في خلايا النحل. تُمكّن هذه التقنية من دراسة المعالجة العصبية عبر مناطق الدماغ المميزة على مستوى العصبونات المفردة والمجموعات في الحيوانات الفاعلة.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- علم الأعصاب
- الفيزيولوجيا الكهربائية
- علم الأحياء السلوكي
الخلفية
- فهم المعالجة الشمية في خلايا النحل ضروري للحصول على رؤى حول تكوين الذاكرة.
- الأساليب السابقة افتقرت إلى القدرة على التسجيلات المتزامنة من مناطق الدماغ المتعددة.
- تعتبر خلايا النحل كائنًا نموذجيًا لدراسة الشبكات العصبية المعقدة.
- يمكن أن يؤدي التحقيق في آليات ترميز الرائحة إلى تعزيز فهمنا للمعالجة الحسية.
هدف الدراسة
- دراسة الترميز الشمي وتكوين الذاكرة في خلايا النحل.
- تطوير تقنية للتسجيلات المتزامنة من مراحل المعالجة العصبية المختلفة.
- فهم العلاقات في ترميز الرائحة بين مجموعات العصبونات.
الطرق المستخدمة
- تجميع أقطاب كهربائية متعددة القنوات منخفضة التكلفة من الأسلاك النحاسية المعزولة.
- تحضير خلايا النحل لإدخال القطب الكهربائي عن طريق إزالة جزء من كبسولة الرأس.
- تسجيل النشاط العصبي أثناء التحفيز بالروائح الزهرية والفيرومونات.
- تصور البنية العصبية من خلال التتبعات الفلورية وإعادة البناء ثلاثي الأبعاد.
النتائج الرئيسية
- تسجيلات متزامنة ناجحة من فص اللبلاب وجسم الفطر.
- فهم معزز لآليات ترميز الرائحة في خلايا النحل.
- تبين استقرار الأقطاب الكهربائية متعددة القنوات لتسجيلات ممتدة.
- توفير رؤى حول الشبكات العصبية المتورطة في المعالجة الشمية.
الاستنتاجات
- تسمح هذه التقنية بفهم أعمق لكيفية معالجة خلايا النحل للمعلومات الشمية.
- يمكن تكييفها للاستخدام في كائنات نموذجية أخرى في علم الأعصاب.
- قد تتناول التطبيقات المستقبلية أسئلة رئيسية في علم أمراض الأعصاب والمعالجة الحسية.
الأسئلة الشائعة
Executive Industry Relevance
This method enables simultaneous long-term extracellular recordings from two distinct neuronal processing stages in behaving honeybees, providing a unique capability to investigate temporal dynamics in olfactory processing pathways. By capturing multi-unit activity from both the antennal lobe and mushroom body—or parallel tracts connecting them—researchers can de-risk mechanistic hypotheses about sensory integration and memory formation. The approach supports predictive confidence in target validation by revealing how odor-evoked signals propagate across brain regions over time, informing translational models of neural circuit function.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by tracking odor-evoked activity across sequential neuropils to clarify pathway-specific contributions to behavior.
- Operational Value: Provides stable, multi-channel recordings over many hours, reducing variability in longitudinal target engagement studies.
- Predictive Value: Supports mechanistic de-risking by distinguishing sustained versus transient neuronal responses, informing target selectivity and functional relevance.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantifiable, time-resolved neurophysiological outputs that can serve as biomarkers for compound effects on olfactory processing.
- Operational Value: Uses differentially amplified micro-wire electrodes to minimize noise and verify signal origin, enhancing assay reproducibility.
- Scalability: Electrode assembly from insulated copper wires allows low-cost, replicable preparation for multi-condition screening.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Links early sensory processing in the antennal lobe to higher-order integration in the mushroom body, modeling perceptual-to-memory transformation.
- Predictive Confidence: Reveals temporal dissociation in odor responses between neuron populations, supporting biomarker alignment for cognitive or sensory-modulating compounds.
- Disease-Relevant System: Offers a genetically tractable invertebrate model to study conserved principles of sensory gating and adaptive filtering.
Pipeline & Workflow Integration
The technique fits within the discovery continuum by enabling hypothesis-driven interrogation of neural circuit dynamics, supporting lead identification through functional readouts of target engagement, and informing preclinical decisions via mechanistic de-risking of sensory processing pathways.
- Discovery Biology: Supports pathway clarification by comparing activity in antennal lobe (early processing) and mushroom body (integration center) during odor stimulation.
- Screening: Delivers reproducible, multi-unit extracellular recordings that allow comparison of compound effects across independent neuronal tracts.
- Analytics: Employs spike sorting, template matching, and principal component analysis to resolve single-spike events and population-level dynamics.
- Translational Research: Connects immediate odor responses to longer-term neuronal plasticity, relevant for modeling learning and memory processes.
- Enterprise Reuse: Electrode design is adaptable across model organisms and brain regions, promoting platform-level standardization.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity by revealing how odor identity and timing are represented across sequential processing stages.
- Operational Value: Electrode flexibility enables stable recordings in behaving animals for hours to days, improving data yield and reducing attrition.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions by providing direct evidence of target modulation in vivo, decreasing reliance on surrogate endpoints.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of compounds based on their effects on temporal coding fidelity in sensory pathways.
Implementation Considerations
- Requires expertise in honeybee brain anatomy and microsurgical techniques for head capsule preparation and electrode targeting.
- Depends on micro-manipulation tools, fluorescent tracers, and spike sorting software for signal validation and 3D reconstruction.
- Necessitates standardization across teams for electrode impedance testing (~300 kΩ at 1 kHz) and reference electrode placement.
- Adaptation to other model systems requires adjustment of electrode size, insertion depth, and brain stabilization methods.
- Practical limitations include the need for extensive training to identify neuronal tracts via anatomical landmarks and the invasiveness of chronic implantation.
