التصوير المباشر ل ذبابة الفاكهة اليرقات Neuroblasts

الهدف العام من هذا الإجراء هو تفصيل تشريح الجهاز العصبي المركزي السليم من يرقات الطور الثالث. من أجل دراسة انقسامات الخلايا الجذعية غير المتماثلة والتمايز الخلوي وتشكل الشكل. يتم تحقيق ذلك عن طريق زرع الجهاز العصبي المركزي الأول من جسم اليرقات عن طريق التشريح الإجمالي.

الخطوة الثانية هي عزل الدماغ السليم عن الأنسجة الطرفية عن طريق التشريح الدقيق باستخدام أدوات مخصصة. بعد ذلك ، يتم تركيب الأدمغة السليمة إما لتصوير الخلايا الحية أو إخضاعها للتثبيت الكيميائي والتألق المناعي ، وفي النهاية يتم استخدام الفحص المجهري متحد البؤر للقرص الدوار لإظهار الأحداث التي تحكم انقسامات الخلايا الجذعية العصبية وتوفير نظرة ثاقبة ميكانيكية لتطور الجهاز العصبي المركزي. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجالات سرطان الخلايا الجذعية والتطور العصبي.

من خلال المساهمة في فهمنا لكيفية تنظيم تكاثر الخلايا الجذعية ، نعلم أن انقسام الخلايا الجذعية ABER يرتبط بتكوين الورم وصغر الرأس ، وتكشف دراسات التصوير التي أجريناها عن الآليات التي تنظم انقسامات الخلايا الجذعية هذه. العرض المرئي لهذه الطريقة أمر بالغ الأهمية لأنه يصعب تعلم التشريح الدقيق وتركيب الدماغ لأنهما يتطلبان أيدا ثابتة وصبرا وممارسة. ابدأ هذا الإجراء بوضع قطرتين من وسائط التشريح الدافئة على شريحة زجاجية واحدة ، واحدة للتشريح الإجمالي والأخرى للتشريح الدقيق.

ثم انقل عدة يرقات إلى إحدى قطرات الوسائط. بعد ذلك ، انقل الشريحة الزجاجية مع اليرقات إلى مجهر تشريح. الآن قم بتكبير القطرة التي تحتوي على اليرقات بحيث تكون الأطراف الأمامية والخلفية لليرقات مرئية.

أمسك المنطقة الوسطى من يرقات واحدة بزوج من الملقط وامسك منطقة أخرى بجانبها مباشرة بزوج ثان من الملقط. ثم تمزيق اليرقات إلى نصفين. كرر الإجراءات لجميع اليرقات على الغطاء ، وانزلق وتخلص من النصفين الخلفيين.

قم بتكبير اليرقات بحيث تكون خطافات الفم الأمامية مرئية بوضوح. بعد ذلك ، قم بعمل شق صغير أو شق على الجانب الآخر من خطافات فم اليرقات بين عصابات CLE الصدرية الثالثة والبطنية الأولى. بعد ذلك ، أمسك خطافات الفم بالملقط.

قشر البشرة برفق في الاتجاه الأمامي إلى الخلفي واستمر حتى يتعرض الجهاز العصبي المركزي. ثم قم بتمزيق الأنسجة لعزل الجهاز العصبي المركزي عن بقية اليرقات. احرص على عدم إتلاف الجهاز العصبي المركزي والتخلص من العينات التالفة باستخدام حبل عصبي بطني ممزق أو فصوص بصرية مشوهة.

كرر الإجراءات لجميع اليرقات الموجودة على زلة الغطاء. ثم انقل الأنسجة السليمة المزروعة إلى الوسط النظيف الآخر. اسقط على زلة الغطاء للتشريح الدقيق.

استخدم دبابيس التشريح لإزالة الأنسجة المحيطية من الدماغ. حرك المشرط بين الدماغ والأنسجة غير المرغوب فيها وقم بتثبيت النسيج الضام على الشريحة الزجاجية. استخدم الخطاف لإزالة الأنسجة غير المرغوب فيها برفق مع الضغط في نفس الوقت على المشرط إلى زلة الغطاء في حركات الأرجوحة.

اعمل ببطء وبشكل متعمد لإزالة جميع الأقراص من كل دماغ. توخي الحذر حتى لا تزعج مورفولوجيا الدماغ. سيكون للدماغ السليم حبل عصبي بطني سليم وفصوص بصرية مستديرة متماثلة.

الآن اقلب طبق ثقافة نفاذية للغاز مقاس 50 ملم مع فيلم شفاف مواجه لأعلى ، وقم بإيداع قطرة صغيرة من الوسط في وسط الطبق. بعد ذلك ، استخدم خطافا لالتقاط الأدمغة الموجودة أسفل الفصوص البصرية ونقلها إلى قطرة الوسط على الطبق واحدة تلو الأخرى. اجمع خمسة إلى 10 أدمغة في قطرة المتوسط.

ثم ادفعهم إلى الأسفل واحدا تلو الآخر ، حيث سيحاصر الكثير منهم في الغضروف المفصلي بعد ذلك. قم بتوجيه الأدمغة للسماح بتصوير الخلايا العصبية لتصوير الأرومة العصبية البطنية الأمامية. ضع الأدمغة مع الحبل العصبي البطني المواجه لأعلى لمحاذاة الأدمغة بحيث تشير جميع الحبال العصبية البطنية في نفس الاتجاه داخل المستوى XY.

استخدم حقنة أو ماصة نقل بلاستيكية لوضع أربع قطرات زيت كربون هالة على الغشاء المنفذ للغاز. يجب أن يكون حجم كل قطرة زيت مكافئا لبعضها البعض ولقطرة الوسط. بمجرد اكتمالها ، ستشبه القطرات الخمس الجوانب الخمسة على النرد على الطراز الغربي.

بعد ذلك ، قم بخفض زلة الغطاء على المجموعة بحيث تصل إلى جميع القطرات الخمس في نفس الوقت. يقلل الحفاظ على ضغط متساو عبر العينات من احتمالية تعطلها. انتظر حوالي ثلاث دقائق.

عندما يتشتت الزيت والوسط تحت وطأة الغطاء ينزلق تحت نطاق تشريح. قم بخفض زلة الغطاء على سطح الأدمغة بشكل أكبر عن طريق إزالة الوسائط الزائدة باستخدام فتيل مناديل ورقية حتى يلامس زلة الغطاء ، ولا تتجاوز الأدمغة الفتيل لأن هذا سيؤدي إلى تشويه الأنسجة أو انفجار الدماغ لتصوير الخلايا العصبية البطنية الأمامية. يجب تحريك زلة الغطاء قليلا في اتجاه أطراف الحبل العصبي البطني.

يؤدي هذا إلى دوران الدماغ ، مما يجعل فصوص الدماغ على اتصال مباشر مع زلة الغطاء لتسهيل التصوير ، ثم يتم إغلاق الغرفة بواسطة enc. ينزلق الغطاء بكمية صغيرة من زيت الكربون الهالة. يجب تقليل الزيت الزائد الذي ينزف من زلة الغطاء ومسحه بمنديل.

قبل التصوير. أضف قطرة من زيت الغمر إلى زلة الغطاء فوق الأدمغة المثبتة مباشرة للمساعدة في توسيط الهدف مباشرة فوق العينة. ضع العينة المركبة برفق في حاضنة المرحلة 25 درجة مئوية وقم بتغطية الغرفة بغطاءها.

بعد ذلك ، حدد موقع الخلايا العصبية الدماغية المركزية باستخدام الضوء المنقول من خلال التركيز على الخلايا المستديرة الكبيرة الموجودة في المناطق المركزية والوسطى من الفصوص البصرية. بمجرد وضعه في مكانه ، خذ تعريضات سريعة باستخدام متحد البؤر لتحديد الموقع الصحيح وعمق الخلايا العصبية. حدد العمق إلى أول 10 إلى 15 ميكرومتر.

اضبط حسب الحاجة والتقط صورة اختبار أخرى. للتخلص من الانجراف المحوري ، استخدم جهاز تركيز تلقائي مستمر يستخدم مؤشر LED بالأشعة تحت الحمراء أو قم بتصحيح المستوى البؤري يدويا. بمجرد تحديد الخلايا العصبية ذات الأهمية ، قم بتحسين جميع المعلمات قبل التصوير.

الآن قم بتصوير الخلايا العصبية بأكملها عن طريق جمع 12 إلى 14 صورة متباعدة بميكرومتر واحد في المحور Z. اضبط دقة الوقت لالتقاط دورات خلية مفردة أو متعددة من نفس الخلايا العصبية. استخدم فترات من 10 إلى 32 لتصوير دورة الخلية المفردة وفترات من دقيقة إلى ثلاث دقائق لدورات الخلايا المتعددة.

بعد ذلك ، تأكد من أن العينة صحية من خلال مراقبة مدة الانقسام. إذا استغرق الانقسام أكثر من 15 دقيقة ، فانتقل إلى دماغ آخر. سيظهر الدماغ السليم العديد من الخلايا العصبية في نفس مجال الرؤية ، حيث يخضع لعدة جولات من الانقسام.

بمجرد اكتمال التصوير ، قم بتفكيك غرفة الحضانة وتخلص من كل شيء ما عدا أطباق الزراعة المنفذة للغاز. اشطف سطح طبق الثقافة بنسبة 95٪ من الإيثانول وامسح الزيت بمنديل ورقي. كرر الإجراء مرتين أخريين.

يظهر هنا التصوير الحي لانقسامات الخلايا الجذعية للأرومات العصبية في مستحضرات الجبل الكاملة. هذه هي الصور ذات الفاصل الزمني لدورة خلية واحدة من الخلايا العصبية التي تعبر عن GFP Mosin للتحليل الخلوي الدقيق ، يتم تصوير دورة خلية الخلايا العصبية الواحدة في أقل من 32 فواصل زمنية وهذه هي الصور المتتابعة لدورات انقسام الخلايا المتتالية من الخلايا العصبية التي تعبر عن كل من G-F-P-M-O و GFP المسمى علامة الجسيم المركزي.

لتصوير دورات خلايا الخلايا العصبية المتعددة. عادة ما يتم تصوير الأدمغة على فترات زمنية من دقيقة إلى ثلاث دقائق على مدى ساعتين إلى ثلاث ساعات. يتم عرض الإسقاطات متحدة البؤر للخلايا الجذعية الثابتة من مستحضرات التثبيت المنزلي هنا.

لتصوير كل الخلايا العصبية الموجودة على كلا الفصين البصريين ، يتم استخدام تكبير 20 ×. هذا التحليل مفيد بشكل خاص لفحص مورفولوجيا الدماغ الكلية وتحديد أعداد الخلايا العصبية. يمكن تصور غالبية الخلايا العصبية من فص بصري واحد بتكبير 40 ×.

للتحليل الخلوي التفصيلي لعدد قليل من الخلايا العصبية ، يجب استخدام تكبير 100 ×. يظهر هذا الأرومة العصبية الطافرة العديد من الجسيمات المركزية في كل قطب مغزل. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر تجنب تلف الصورة عن طريق الحد من كمية الضوء التي تصيب العينة.

هذه التقنية المتمثلة في تصوير انقسامات الخلايا العصبية الحية في مستحضرات الجبل بالكامل الطريق للباحثين في مجال بيولوجيا الخلايا الجذعية لاستكشاف انقسام الخلايا غير المتماثل في السياق الأصلي الحي لدماغ ذبابة الفاكهة النامي.