دليل ل في الجسم الحي تسجيل وحدة واحدة من التي تم تحديدها Optogenetically القشرية التثبيطي Interneurons

الهدف العام من التجربة التالية هو الحصول على تسجيلات وحدة واحدة خارج الخلية عالية الجودة من الخلايا العصبية القشرية في الفئران التي تعبر عن جذر القناة الثانية. يتم تحقيق ذلك من خلال تطوير قطب تسجيل عالي المقاومة عبر الأنسجة لتحديد الخلايا العصبية الداخلية من الاستجابات المتصاعدة لنبضات الضوء الأزرق. تتم مراقبة الإشارة الكهربائية بحثا عن التغييرات التي تشير إلى المعدل المناسب للتقدم واحتمالية الحصول على تسجيل مستقر معزول جيدا.

إذا تعذر تحقيق عزل جيد لوحدة واحدة أو على العكس من ذلك نادرا ما تصادف الخلايا العصبية المستجيبة للضوء ، فاستبدل قطب التسجيل. تظهر النتائج أن موثوقية الضوء تثير استجابات من الخلايا العصبية المحددة بصريا ونسبة الإشارة إلى الضوضاء النموذجية التي تم الحصول عليها باستخدام هذه الإستراتيجية. يعد نهج تحفيز الصور طريقة سهلة الوصول وغير مكلفة لاستهداف أنواع الخلايا المحددة وراثيا باستخدام مكبر صوت قياسي خارج الخلية والضوء الأزرق.

هذه هي استراتيجيتنا للقوادة على خلايا عصبية داخلية معينة في تخدير القشرة السمعية ، ولكن النقاط الأكثر عمومية تنطبق على المناطق القشرية الأخرى من أنواع الخلايا المتناثرة لبدء هذا الإجراء. بعد تخدير بكوكتيل الكيتامين مين عن طريق الحقن داخل الصفاق ، ضعه في جهاز تجسيمي أو أي جهاز آخر لحمل الرأس ، وتأكد من أن الجمجمة مؤمنة جيدا. هذا ضروري للحفاظ على تسجيلات خلية واحدة مستقرة.

بعد ذلك ، ضع مرهم العين على العينين لمنع الجفاف والحفاظ على درجة حرارة جسم عند 37 درجة مئوية لإجراء استنزاف قصي CI لمزيد من الاستقرار للتسجيل ، وإزالة الأنسجة من الجمجمة الخلفية بشفرة مشرط لفضح CI sternum magna. ثم قم بعمل شق صغير في الدرة بطرف الشفرة لتصريف السائل الشوكي الدماغي. الآن باستخدام المشرط ، قم بإجراء بضع قحف صغير فوق منطقة القشرة المعنية.

بعد ذلك ، قم بإزالة الجافية ، ثم قم بتغطية القشرة المكشوفة بطبقة من الأروس الدافئ. حافظ على رطوبة agros بالمحلول الملحي. تحضير قطب ألسنة الوقوف.

قم بلصق القطب الكهربائي بأنبوب شعري زجاجي مع غراء فائق ومسرع. ثم أضف أنابيب الانكماش الحراري للقبضة. بعد ذلك ، قم بتركيب القطب الكهربائي على مناور ميكروم آلي أو هيدروليكي واضبطه على الانتقال متعامد إلى السطح القشري.

حرك سلكا أرضيا تحت الجلد على الجمجمة. تجنب ملامسة العضلات الموجودة على جانب الرأس ومؤخرة الرقبة لأنها يمكن أن تولد تحفا رسومية ميو. يتم تضخيم الإشارة الكهربائية باستخدام مكبر للصوت خارج الخلية مناسب لتسجيل وحدة واحدة ، ويفضل أن يكون مزودا بوضع فحص المقاومة.

تتم مراقبة نشاط الارتفاع المستمر باستخدام اثنين من راسمات الذبذبات ومجموعة من مكبرات الصوت التي تعمل بالطاقة. الآن قم بتطوير القطب الكهربائي عبر agros واختبر مقاومتها للتأكد من أنه في حدود سبعة إلى 14 ميجا أوم. عندما يخترق الطرف سطح القشرة ، قم بصفر هذا الموضع على مناور الميكروم.

لتقدير عمق التسجيل بشكل أفضل ، تأكد بصريا من أن طرف القطب يخرج من السطح القشري على عمق الصفر. عند سحب القطب الكهربائي في نهاية الاختراق في القشرة السمعية للتأكد من أن نقطة ضبط مجموعة الصفر هذه تتوافق مع مستوى القشرة ، يراقب التحفيز يثير إمكانات المجال أثناء تقدم القطب الكهربائي عبر أول عدة مئات من الميكرومترات من الأنسجة ، تأكد من أن قطبية جهد المجال المحلي تنعكس حول عمق 100 ميكرومتر.

بعد ذلك ، قم بتركيب ألياف ضوئية مقترنة بمصدر ضوء أزرق على مناور دقيق يدوي. قم بتنظيم إخراج مصدر الضوء باستخدام وحدة التحكم القادرة على توصيل قطار نبضات TTL بعرض ومدة محددين. ثم راقب الإشارة على كلا الذبذبات.

قم بقياس إجمالي طاقة الضوء عند طرف الألياف الضوئية باستخدام مقياس الطاقة. استخدم هذه القيمة لحساب الإشعاع بقسيمه على مساحة المقطع العرضي للب الألياف. ابدأ بالقيمة في حدود 10 إلى 15 مللي واط لكل ملليمتر مربع.

باستخدام المجهر ، ضع طرف الألياف بالقرب من سطح الحروس قدر الإمكان. قم بتوسيط الحزمة حيث سيدخل القطب إلى الأنسجة. تحقق الآن من القطع الأثرية الخفيفة مع وجود القطب الكهربائي في aros.

قم بتوصيل إجهاد النبض. تخلص من أي قطع أثرية ضوئية عابرة عن طريق إعادة وضع الألياف الضوئية بالنسبة إلى القطب الكهربائي لتغيير زاوية الضوء الساقط. إذا استمرت القطع الأثرية ، فحاول تقليل طاقة الضوء.

بعد ذلك ، قم بدفع القطب الكهربائي ببطء عبر الدماغ بمعدل ميكرومتر واحد تقريبا في الثانية. استخدم راسم الذبذبات لمراقبة النشاط المستمر للقطب. استخدم الآخر لتشغيل نبضات الليزر.

استمع إلى التجزئة الخافتة للطفرات التي يثير الضوء على شاشة الصوت ، مما يشير إلى أن القطب يقترب من خلية إيجابية للقناة. ثم قم بإبطاء معدل التقدم بمجرد أن يستحضر الضوء. المسامير كبيرة بما يكفي ليتم تشغيلها بشكل فردي على راسم الذبذبات.

ابدأ في القيام بذلك. اضبط مقياسا على المحور الأفقي لمراقبة الشكل الدقيق لشكل موجة السنبل. في هذه المرحلة ، توقف عن تقدم القطب الكهربائي وانتظر حتى يستقر في الأنسجة.

هذا أمر بالغ الأهمية لتسجيل مستقر. بعد عدة دقائق ، إذا لم تتحسن نسبة الإشارة إلى الضوضاء ، فتقدم خمسة ميكرومترات وانتظر. مرة أخرى ، كرر هذه العملية حتى يمكن التقاط ذروة أو قاع جهد الفعل بشكل موثوق بعتبة الجهد.

اضبط أعلى بكثير من أرضية الضوضاء أثناء التسجيل. مراقبة النشاط المستمر على راسم الذبذبات الأول. في الوقت نفسه ، انتبه إلى حجم وشكل المسامير باستخدام راسم الذبذبات الثاني ولاحظ جودة صوتها على السماعة.

استمع باهتمام إلى التغييرات المفاجئة ، والتي تشير إلى أن الخلية إما تقترب كثيرا من القطب الكهربائي أو تنجرف بعيدا. إذا أصبحت المسامير كبيرة ومشوهة ، اسحب القطب. إذا أصبحت أصغر ، فقم بدفع القطب.

تحرك ببطء في خطوتين ميكرومترية لتأكيد جودة المسامير. قم بتركيب كل شكل موجة الارتفاع عبر مجموعة واسعة من قيم العتبة. يجب رؤية شكل سبايك واحد فقط من ارتفاع موحد.

يمكن لمعظم الخلايا الكهروضوئية الإيجابية أن تحافظ على إطلاق النار لمدة ثانية واحدة كاملة. إذا أصبحت الإشارة ملوثة بمسامير من خلية عصبية مجاورة ، وقم بتطوير القطب الكهربائي وابحث عن خلية جديدة في كل اختراق ، فقم بخفض القطب الكهربائي عبر عمق القشرة بالكامل. إذا لم تتم مصادفة الخلايا العصبية المستجيبة للضوء بعد العديد من الاختراقات أو على العكس من ذلك ، فإن التسجيلات ملوثة بشكل روتيني بمسامير من القناة المجاورة ، الخلايا السالبة opsin ، جرب قطبا كهربائيا جديدا.

يوضح هذا الشكل أمثلة على التسجيلات من ثلاثة أنواع من الخلايا العصبية البينية المحددة بصريا. تستجيب الخلايا لقطار نبض البحث بدفعة موثوقة من المسامير. يظهر هنا 100 طن من المسامير ومتوسط شكل الموجة المقحم.

تظهر مخططات القائمة هذه التوقيت المتسق للمسامير التي تثيرها الضوء. زمن انتقال الارتفاع الأول لعينة من الطاقة. يتم عرض الخلايا العصبية الداخلية الموجبة فولين هنا.

نهج تحفيز الصور بسيط للغاية من الناحية المفاهيمية ، ولكنه قد يكون صعبا بشكل مدهش وعائد منخفض. في الممارسة العملية. أقطاب التصحيح الزجاجية متحيزة بشدة نحو الخلايا العصبية البارافلاتية ، لذلك لا تحصل على الخلايا العصبية الداخلية كثيرا.

من ناحية أخرى ، مع tetros ، تحصل على الكثير من الخلايا العصبية الداخلية المستجيبة للضوء ، لكن المسامير صغيرة وهناك الكثير من أشكال الموجات المتداخلة ، لذلك من الصعب جدا فرزها بشكل موثوق إلى وحدات مفردة. نحاول تحقيق هذا بعدة طرق مختلفة ، وبالنسبة للخلايا العصبية الداخلية ، وجدنا أن هذه الأقطاب الكهربائية الحادة من 10 إلى 14 ميجا حققت التوازن الصحيح من حيث نصف قطر الاستماع ، والذي يجب أن يكون كبيرا بما يكفي لاكتشاف ضوء مسامير البلوط من مسافة بعيدة ، ولكنه مقيد بما يكفي لتحقيق عزل جيد لوحدة واحدة. هناك بعض الفودو على الرغم من ذلك.

إذا لم تتمكن من تحقيق ذلك ، فستوفر على نفسك الكثير من الوقت بمجرد التخلي عن هذا القطب والانتقال إلى التالي حتى تجد واحدا يعمل.