التصوير في الوقت الحقيقي من غشائي المفارق خلايا العدلات خلية أثناء التهجير تحت الفسيولوجية تدفق
أغسطس 14, 2014
الكريات البيض تعبر أحادي الطبقة البطانية باستخدام paracellular أو الطريق العابر للخلايا. وضعنا مقايسة بسيطة لمتابعة توزيع موصلي الذاتية VE كادهيرين وPECAM-1 خلال الكريات البيض transendothelial الهجرة تحت تدفق الفسيولوجية للتمييز بين طرق التهجير اثنين.
الهدف العام من هذا الإجراء هو متابعة توزيع الوصلات الذاتية ، والتيرين ، و PCAM واحد أثناء الهجرة البطانية عبر الكريات البيض في ظل ظروف التدفق الفسيولوجي. يتم تحقيق ذلك عن طريق عزل الكريات البيض متعددة الأشكال أو PMNs أولا عن الدم الكامل للمتطوعين الأصحاء باستخدام تدرج بروكو. تتمثل الخطوة الثانية في إضافة الأجسام المضادة المصنفة بالفلورسنت إلى طبقة أحادية الطبقة أحادية للخلية البطانية للوريد السري البشري المحفزة من عامل نخر الوريد السري البشري المزروعة في شرائح التدفق قبل 30 دقيقة من بدء تجربة التدفق.
سيمكن ذلك من تصور ديناميكيات التوصيل للخلايا البطانية أثناء انتقال العدلات في ظل ظروف التدفق الفسيولوجي. بعد ذلك ، يتم توصيل شريحة التدفق التي تحتوي على الخلايا البطانية للوريد السري البشري المحفز بالفلورسنت بنظام التدفق ووضعها على مرحلة المجهر. ستقوم المضخة بسحب مخزن التدفق من الخزان عبر غرفة التدفق إلى المحقنة.
الخطوة الأخيرة هي حقن PMNs ببطء في نظام التدفق عبر منفذ الحقن. في النهاية ، يتم تصور PMNs باستخدام مجهر المسح الضوئي بالليزر متحد البؤر. بعد بضع دقائق ، تظهر الكريات البيض وتلتصق وتتحول.
يمكن إيقاف التجربة في أي لحظة مرغوبة. الميزة الرئيسية لهذه التقنية على الطرق الأخرى الموجودة مثل فحوصات التحويل الثابت ، هي أنه باستخدام هذه التقنية يمكنك دراسة الالتصاق والتحول في الحياة الواقعية في ظل ظروف التدفق الفسيولوجي. سيساعدنا هذا على فهم سبب اختيار الكريات البيض لجذر واحد على الآخر ، لذلك PGA مقابل الهجرة عبر الخلايا.
نقوم بذلك عن طريق تصور تقاطعات خلايا الخلية مع الأجسام المضادة المصنفة بالفلورسنت. يتم استزراع الخلايا البطانية للوريد السري البشري أو HU X لهذه التجربة وفقا لتعليمات الشركة المصنعة على الأطباق المغلفة بالفبرونيكتين باستخدام وسائط مكملة بنمو البطانة. متوسط. تستخدم زراعة الخلايا بين أربعة إلى ثمانية مقاطع عندما تصل الخلايا إلى 80 إلى 90٪ التقاء تغسلها بعناية باستخدام PBS بدرجة حرارة الغرفة عند درجة الحموضة 7.4 ثم التربسين هو الخلايا بعد التربسين والطرد المركزي.
نعلق عند 800 ، 000 خلية لكل مليلتر باستخدام الوسائط. تستخدم التجربة غرف التدفق المطلية بالفبرونيكتين على لوحة اليوم السابق. 80،000 خلية في كل قناة واحدة من غرف التدفق المشفرة للفيبرونيكتين وتقوم بلطف بتعليق الخلية لأعلى ولأسفل المزرعة طوال الليل في حاضنة عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون في اليوم التالي.
قم بتحديث الوسائط في شريحة غرفة التدفق عن طريق إمالة الشريحة برفق بزاوية 45 درجة. يوصى بإزالة الوسائط الموجودة في الخزانات فقط وليس في القناة نفسها. قد تؤدي إزالة الوسائط في القنوات إلى فقدان الخلايا البطانية وموتها بسبب قوة سحب الوسائط الناتجة عن سحب العينات.
تحقق من الفحص المجهري المتباين للطور إذا كانت الخلايا البطانية قد شكلت طبقة أحادية. إذا لم تكن الخلايا متماسكة بنسبة 100٪ ، فقم بتغيير الوسائط مرتين في اليوم حتى تصل إلى التقاء بنسبة 100٪. بمجرد أن تصل الخلايا إلى 100٪ من الطلاقة المشتركة ، قم بتحفيز الخلايا بوسائط تحتوي على الوسيط الالتهابي.
ينتج عن عاملنخر الورم ألفا الذي يحفز uix بين عشية وضحاها مع عامل نخر الوراز ألفا نمط ظاهري التهابي لتنظيم البطانة IE لجزيئات التصاق الخلية مثل ICAM one و VA M1. قبل عزل الكريات البيض متعددة الأشكال أو PMNs. قم بإعداد مخزن مؤقت للتدفق لغسل PMNs المعزولة ولاستخدامه في مقايسة التدفق إلى 100 مل من محلول مخزون معد مسبقا. عند 100 ميكرولتر من كلوريد الكالسيوم المولي الطازج ، و 2.5 مل من الألبومين البشري من تركيز 200 جرام لكل لتر و 0.1 جرام من الجلوكوز.
قم بتصفية المخزن المؤقت للتدفق باستخدام مرشح 0.45 ميكرون. يتم أيضا تحضير 10٪ سترات ثلاثي الصوديوم أو محلول TNC في PBS عند درجة الحموضة 7.4 قبل عزل PMNs. سيتم عزل PMNs من 20 مل من الدم الكامل الذي تم جمعه في هيبارين الصوديوم من متطوع سليم.
قم أولا بتخفيف الدم بالكامل واحدا إلى واحد باستخدام 10٪ PBST NNC في أنبوب 15 ملليلتر. بعد ذلك ، استخدم صبي ماصة في أبطأ إعداد لماصة 20 مل من الدم المخفف بعناية على 12.5 مل من كل محلول غروي مشترك في الماء بكثافة 1.130 جرام لكل مليلتر في أنبوب جديد سعة 50 مل. يجب إمالة الأنبوب المحتوي على كل كول بزاوية 45 درجة أثناء إضافة الدم.
ضع الأنابيب بعناية في جهاز الطرد المركزي وتدور في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة عند 800 جيجابايت مع تسارع منخفض مع تعطيل الفرامل عند اكتمال الطرد المركزي. قم بإزالة كل السائل واملأ كل أنبوب بمحلول تحلل كريات الدم الحمراء المثلجة لغسل كريات الدم الحمراء. اترك الأنابيب على الجليد ، وقلبها من حين لآخر حتى يتحول نظام التعليق إلى جهاز طرد مركزي أحمر داكن عند 500 GS لمدة خمس دقائق عند أربع درجات مئوية مع تمكين الفرامل.
يحتوي جزء الحبيبات الناتج على PMNs جنبا إلى جنب مع كريات الدم الحمراء ، قم بإزالة المادة الطافية وغسل الحبيبات مرتين في الثلج. مخزن التحلل البارد عند 500 جم لمدة خمس دقائق عند أربع درجات مئوية. بعد إزالة المادة الطافية من الغسيل الثاني ، أعد تعليق الحبيبات باستخدام عازلة التدفق في درجة حرارة الغرفة وحدد تركيز PMNs باستخدام عداد خلية آلي.
أخيرا ، قم بتعليق PMNs في المخزن المؤقت للتدفق مرة واحدة 10 إلى الخلايا الست لكل مليلتر واحتفظ بها في درجة حرارة الغرفة لتسمية VA cadherin الوصلي البطاني و pcam واحد. أضف الجسم المضاد PCAM LOR 6 47 عند تخفيف واحد إلى 100 والجسم المضاد FE cadherin ZI المستقل عن الكالسيوم عند تخفيف من واحد إلى 50 إلى ثقافة VE ، متوسطة في غرفة التدفق واحتضانها عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. لتحضير PMNs للفحص ، ضعها في حمام مائي لمدة 15 دقيقة عند 37 درجة مئوية قبل حقنها في نظام التدفق.
قم بتوصيل الأنبوب بغرفة تدفق فارغة واملأه بمخزن مؤقت للتدفق الدافئ لمنع تكوين فقاعات الهواء. عند إعداد نظام التدفق. باستخدام أنابيب السيليكون ، قم بتوصيل جانب واحد من غرفة التدفق الفارغة بنظام تدفق مضخة الحقنة الذي يحتوي على حقنة سعة 20 ملليلترا.
ضع غرفة التدفق على مرحلة المجهر. سيتم إجراء الفحص باستخدام مجهر المسح الضوئي بالليزر متحد البؤر المجهز بهدف الزيت 63 × وغرفة مناخية مثبتة عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون. قم بتوصيل الجانب الآخر من غرفة التدفق الفارغة بقارورة الخزان المملوءة بمخزن مؤقت للتدفق 37 درجة مئوية وابدأ تشغيل مضخة الحقنة من أجل ملء كل الأنابيب بمخزن مؤقت للتدفق ، وستقوم المضخة بسحب مخزن التدفق من الخزان عبر غرفة التدفق إلى المحقنة.
يحتوي هذا الأنبوب أيضا على منفذ حقن إغراء مضمن ، والذي يسمح بحقن PMNs بإبرة في تجربة جارية دون إيقاف التدفق وإنشاء فقاعات هواء. بعد ذلك ، استبدل غرفة التدفق الفارغة بغرفة التدفق التي تحتوي على قرص VE المعالج بعامل نخر الوراز ألفا من الأنابيب قبل فصلها وإعادة توصيلها بالغرفة التي تحتوي على VE.To تجنب فقاعات الهواء في النظام ، فمن الأهمية بمكان قرصة الأنابيب وتثبيتها. عند توصيل الشريحة التي تحتوي على الخلايا.
ضع غرفة التدفق على مرحلة المجهر ، واضبط سرعة التدفق على سنتيمتر واحد مربع وفقا لسرعة التدفق الفسيولوجي في ما بعد الشعيرات الدموية ، وهي واحدة إلى خمسة طعام لكل سنتيمتر مربع تباين التداخل التفاضلي السجل أو DIC fite LOR 6 47. في نفس الوقت باستخدام حقنة سعة مليلتر واحد ، قم بحقن PMN ببطء في نظام التدفق عبر منفذ حقن الإغراء المضمن. بعد بضع دقائق ، تظهر الكريات البيض ، وتلتصق وتتحول إلى توقف التجربة في أي لحظة مرغوبة.
من خلال فصل الأنبوب من غرفة التدفق وتثبيت الماصة في غرفة التدفق ، تم قياس مقاومة الطبقات الأحادية البطانية لاختبار ما إذا كانت الأجسام المضادة تتداخل مع وظيفة الحاجز في البطانة. لم يلاحظ أي تغيير في المقاومة عندما كان بإمكان VE سماع استنساخ الجسم المضاد 55 7 H واحد أو تمت إضافة عنصر التحكم في النمط المتماثل إلى الخلايا. في المقابل ، قلل الجسم المضاد CL 75 الذي يمنع السمع من المقاومة بشكل كبير.
كشف تحليل RAP عن عدم وجود أي تغيير في استعادة التألق في وجود أو عدم وجود الجسم المضاد VE CADHERIN 55 7 H ، مما يشير إلى أن الجسم المضاد لم يغير ديناميكيات VE cadherin و VE cadherin و pcam تم تحليل توزيع واحد أثناء الهجرة البطانية عبر العدلات أو TEM في الوقت الفعلي. تظهر اللوحة العلوية عدلات محددة باللون الأبيض تلتصق بالبطانة وتعبر الخلية إلى تقاطع الخلية دون الإضرار بتوزيع تماسك VE و PCAM واحد. أثناء داء الحجاب ، يمكن ملاحظة التشتت الموضعي لمتماسك VE و P chem الأول عندما يبرز عدلات عبر الخلية إلى تقاطعات الخلايا الموضحة باللون الأبيض عبارة عن عدلات أعلى البطانة.
يوضح المخطط الأصفر غشاء العدلات الموجود بالفعل تحت البطانة. بعد الانتهاء من داء الحجاب السكري ، يتم نقل التقاطعات قريبة و ve متماسكة و pcam واحد في مواقع داء السجاب. يتم تحديد حدود العدلات المهاجرة باللون الأصفر.
بعد هذا الإجراء ، يمكن إجراء الهجرة البطانية عبر الكريات البيض من أجل الإجابة على أسئلة إضافية مثل ما إذا كانت الكريات البيض تعبر البطانة باستخدام الباجة أو الجذر عبر الخلايا.
نظرة عامة
تقدم هذه الدراسة طريقة جديدة للتحقيق في ديناميات الهجرة العابرة للأوعية الدموية للخلايا البيضاء تحت ظروف التدفق الفسيولوجية. من خلال تصور بروتينات الوصل VE-cadherin وPECAM-1، تهدف الدراسة إلى التفرقة بين مسارات الهجرة بين الخلايا وعبر الخلايا.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلوم
- بيولوجيا الخلية
- علم المناعة
- بيولوجيا الأوعية الدموية
الخلفية
- تهاجر الخلايا البيضاء عبر البطانة عبر مسارين رئيسيين: بين الخلايا وعبر الخلايا.
- فهم هذه المسارات أمر بالغ الأهمية للحصول على رؤى حول الاستجابات المناعية والالتهاب.
- VE-cadherin وPECAM-1 هما بروتينات وصل رئيسية متورطة في التصاق الخلايا البطانية.
- تفتقر الطرق الحالية إلى القدرة على دراسة هذه العمليات تحت ظروف التدفق الفسيولوجية.
هدف الدراسة
- تطوير طريقة تسمح بالملاحظة في الوقت الحقيقي لهجرة الخلايا البيضاء.
- التفرقة بين مسارات الهجرة بين الخلايا وعبر الخلايا.
- تعزيز فهم سلوك الخلايا البيضاء خلال الالتهاب.
الطرق المستخدمة
- عزلة الخلايا البيضاء متعددة الأشكال (PMNs) من دم المتطوعين الأصحاء.
- استخدام الأجسام المضادة الموصوفة بالفلورسنت لتصوير ديناميات الوصل.
- إعداد غرفة التدفق لمحاكاة الظروف الفسيولوجية.
- الميكروسكوب الضوئي بالمسح بالليزر المتحد البؤر لملاحظة سلوك الخلايا البيضاء في الوقت الحقيقي.
النتائج الرئيسية
- التصوير الناجح للتصاق الخلايا البيضاء والهجرة العابرة.
- تحديد ديناميات الوصل استجابةً لهجرة PMNs.
- تبيان مزايا الطريقة مقارنة بالطرق الساكنة.
- رؤى حول تفضيل الخلايا البيضاء لمسار معين للهجرة.
الاستنتاجات
- توفر الطريقة المطورة أداة قيّمة لدراسة هجرة الخلايا البيضاء.
- يمكن أن يساعد فهم آليات الهجرة العابرة في توجيه الاستراتيجيات العلاجية للأمراض الالتهابية.
- تسلط النتائج الضوء على أهمية التدفق الفسيولوجي في دراسات سلوك الخلايا البيضاء.
الأسئلة المتداولة
Executive Industry Relevance
This assay enables real-time visualization of endothelial junctional dynamics under physiological flow, addressing a critical gap in modeling leukocyte transmigration for anti-inflammatory target validation. By distinguishing paracellular from transcellular migration routes, it provides mechanistic insights that support de-risking of therapeutic candidates targeting endothelial adhesion pathways. The approach enhances predictive confidence in preclinical models by replicating hemodynamic conditions relevant to post-capillary venules.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of VE-cadherin and PECAM-1 dynamics to clarify molecular mechanisms of leukocyte transmigration.
- Operational Value: Uses fluorescently labeled antibodies that do not interfere with junctional protein function, validated by impedance sensing and FRAP.
- Predictive Value: Supports hypothesis testing of whether compounds modulate paracellular versus transcellular leukocyte passage.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates quantitative, real-time readouts of junctional protein redistribution during neutrophil transmigration under flow.
- Reproducibility: Standardized flow chamber setup with physiological shear stress (1–5 dynes/cm²) enables consistent leukocyte adhesion and transmigration measurements.
- Screening Utility: Facilitates compound screening for effects on endothelial barrier integrity and leukocyte migration routes.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Models inflammatory conditions via TNF-α stimulation, upregulating adhesion molecules like ICAM-1 and VCAM-1.
- Translational Continuity: Bridges in vitro findings to in vivo leukocyte behavior by incorporating physiological flow, a key variable missing in static assays.
- Mechanistic De-risking: Clarifies whether test compounds affect junctional remodeling versus endothelial cell body penetration, informing target mechanism of action.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target validation through lead optimization, particularly for immunomodulatory compounds where leukocyte endothelial interaction is a key pharmacodynamic biomarker.
- Discovery Biology: Supports pathway clarification by visualizing real-time junctional protein dynamics during leukocyte transmigration.
- Screening: Delivers quantitative, time-resolved imaging outputs that allow comparison of compound effects on migration route preference.
- Analytics: Enables measurement of junctional dispersion and recovery kinetics, providing statistical endpoints for comparing experimental conditions.
- Translational Research: Models human venous endothelium under flow, improving relevance to preclinical vascular inflammation models.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for studying leukocyte-endothelial interactions across multiple antibody or small molecule programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in leukocyte migration studies by directly visualizing junctional protein dynamics.
- Operational Value: Standardized protocol using flow chambers and confocal microscopy ensures reproducibility across laboratories.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions by identifying whether candidates preferentially block paracellular transmigration, a key anti-inflammatory mechanism.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of compounds based on effects on endothelial junctional stability under physiological conditions.
Implementation Considerations
- Requires expertise in cell culture, immunofluorescence staining, and microfluidic flow system setup.
- Dependent on confocal laser scanning microscopy with environmental control for temperature and CO₂.
- Necessitates standardization of TNF-α stimulation timing and antibody labeling protocols across users.
- Adaptation to other cell types or disease models may require validation of junctional marker specificity and flow compatibility.
- Practical limitations include the need for fresh primary neutrophil isolation and short-term antibody labeling windows to avoid functional perturbation.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:59
Plating and Maintenance of Human Umbilical Vein Endothelial Cells
4:00
Polymorphonuclear Leukocyte Isolation Using Percoll Gradients
6:36
Labeling of Endothelial Junctional VE-cadherin and PECAM-1 and Performing the PMN TEM Assay Under Flow
9:24
Results: Visualization of the Dynamics of VE-cadherin and PECAM-1 During Neutrophil TEM
10:59
Conclusion
