التصوير مضان مع نانومتر دقة واحدة (FIONA)

الهدف العام من هذا الإجراء هو توضيح كيفية إجراء التصوير الفلوري بدقة نانومتر واحد أو تجارب فيونا. يتم تحقيق ذلك عن طريق إعداد المعدات المطلوبة أولا ومحاذاة البصريات للانعكاس الداخلي الكلي أو التألق أو الفحص المجهري أو العشب. الخطوة التالية هي تثبيت CY 3D NA على السطح الداخلي لغرفة العينة وتوطين الجزيئات المفردة CY 3D NA بدقة نانومتر.

بعد ذلك ، يتم تطبيق فيونا لدراسة حركة الميوسين المقطوع الواحد خمسة محرك المسمى بنقطة كمومية. في النهاية ، حجم خطوة الميوسين أثناء سيره ، تم قياس أكتون على أنه 36 نانومتر بواسطة تحليل فيونا. على الرغم من أن هذه الطريقة يمكن أن توفر نظرة ثاقبة للمحركات الجزيئية ، إلا أنه يمكن تطبيقها أيضا على أنظمة أخرى مثل تتبع المستقبلات على غشاء الخلايا.

العرض المرئي لهذه الطريقة أمرا بالغ الأهمية حيث يصعب تعلم التفاصيل التجريبية. من المهم ارتداء نظارات واقية بالليزر في جميع الأوقات أثناء الإعداد. للانعكاس الداخلي الكلي أو التألق أو الفحص المجهري أو العشب.

للبدء ، اضبط ارتفاعات جميع المكونات البصرية على ارتفاع مركز المجهر ، والمنفذ الخلفي ، وقم بتركيب الليزر ، ومصراع الليزر ، ومرشحات ND. استخدم مرشحات ND لتخفيف طاقة الليزر إلى أدنى مستوى ممكن مع الحفاظ على الشعاع مرئيا. شد البراغي بالمفاتيح السداسية المناسبة.

خطط لمسار شعاع كما هو موضح في الخطوط الزرقاء المنقطة. في هذا التخطيطي ، ضع علامة على مسار الشعاع بشريط أو علامة على الجدول البصري. ضع المرآة M1 عند أول منعطف بزاوية قائمة ، ضع القزحية على طول القسم الثاني المستقيم من مسار الشعاع المخطط له.

اضبط كل من موضع وإمالة M1 بحيث يمر الليزر عبر مرآة وضع القزحية M اثنين. في الزاوية اليمنى الثانية ، ضع موسع الشعاع 10 × على طول القسم الثالث المستقيم من المسار. اضبط إمالته بحيث يكون موسع الحزمة موازيا لكل من الجدول البصري ومسار الحزمة المخطط له.

الخطوة التالية هي ضبط M1 و M اثنين بشكل متكرر بحيث يمر الليزر مباشرة عبر مراكز كلتا العدستين ، L واحد و L اثنان من موسع الحزمة. استخدم قطعة من الورق الأبيض لمنع الشعاع بعد موسع الشعاع للتحقق من ملف تعريف الشعاع بالعين. اضبط حتى يصبح ملف تعريف الشعاع للحزمة الموسعة غير ED.

Gaussian بضبط المسافة بين L واحد و L اثنين بحيث يتم تجميع الشعاع مصراع. يقوم الليزر بفك هدف المجهر والمسمار في محاذاة الفلورسنت. مرايا المكان المستهدف M ثلاثة و M أربعة لتوجيه الحزمة الموسعة إلى منفذ المجهر وعلى المرآة ثنائية اللون.

داخل البرج. اضبط M ثلاثة لتوسيط الجزء الأكثر سطوعا من الشعاع على هدف الفلورسنت و M أربعة لجعل الشعاع يميل عموديا ، ويغلق الليزر ويثبت الهدف مرة أخرى. غرامة. اضبط إمالة M three و M four لتحسين قوة الليزر وملف تعريف الشعاع خارج الهدف.

قم بتركيب كاميرا E-M-C-C-D على المجهر وقم بتوصيل الكاميرا بجهاز كمبيوتر. ابدأ تشغيل برنامج الكاميرا. قم بتركيب عينة فلورية على المجهر.

انظر إلى بقعة الفلورسنت الساطعة على الكاميرا. تأكد من عدم تغيير البقعة على الشاشة حيث تغير التركيز. ضع عدسة TIR على مرحلة الترجمة XY ، Z على مسافة من المستوى البؤري الخلفي للهدف الذي يساوي البعد البؤري ، L ثلاثة ، والذي يبلغ حوالي 30 سم.

اضبط موضع L ثلاثة بحيث يمر الليزر عبر مركز العدسة. قم بترجمة L ثلاثة على طول مسار الشعاع لضبط ترتيب الحزمة. تأكد من أن الشعاع لا يزال متمركزا على الشاشة ومتناظرا في الشكل.

قم بترجمة L ثلاثة عموديا على مسار الشعاع لإمالة الشعاع خارج الهدف. استمر في ترجمة عدسة TIR بحيث يتم تحقيق TIR قبل تنفيذ Fiona. تجربة توطين وتعبئة CY 3D NA. تقوم الجزيئات المفردة ببناء غرف عينة كما هو مفصل في نص البروتوكول.

يتم تطبيق شريطين من الشريط على الوجهين على الشريحة على طول الحواف الطويلة ، مما يترك فجوة من ثلاثة إلى خمسة ملليمترات في المنتصف ثم يتم وضع زلة غطاء نظيفة أعلى مناظر جانبية منزلقة للغرفة من اليمين ومن الأمام. تترك الأطراف المفتوحة للغرفة مفتوحة وتعمل كمدخل ومخرج لتثبيت SI 3D NA على الأسطح الداخلية لغرفة العينة. ماصة 10 ميكرولتر من بيوتين BSA في الغرفة.

انتظر لمدة خمس دقائق. اغسل حجرة العينة عن طريق سحب 40 ميكرولتر من T 50 BSA في الغرفة. ثم ماصة 10 ميكرولتر من الترافان المحايد في الغرفة واحتضانها لمدة خمس دقائق.

اغسل الحجرة مرة أخرى باستخدام 40 ميكرولترا من ماصة T 50 BSA ، و 20 ميكرولترا من SI 3D NA في غرفة العينة واحتضانها لمدة خمس دقائق. أخيرا ، اغسل الغرفة ب 80 ميكرولتر من T 50 BSA. لبدء إجراء تصوير الجزيئات المفردة SI 3D NA تحت العشب ، ضع ماصة M 30 ميكرولترا من المخزن المؤقت للتصوير في غرفة العينة وانتظر لمدة ثماني إلى 10 دقائق.

قم بتركيب العينة للتصوير على مجهر العشب المجهز بليزر أخضر ، وهدف غمر الزيت 100 X ، وكاميرا E-M-C-C-D. اضبط وقت التعرض وكسب EM. احصل على فيلم من العينة ل 1000 إطار.

قم بتجميع وتشغيل Fiona Pro لتحليل Fiona. استخدم برنامج IDL هذا لاستيراد الصورة المكتسبة لإدخال حجم البكسل الفعال وعامل التحويل من الشدة إلى رقم الفوتون واختيار النقاط لتحليل فيونا. في النهاية ، سيقوم البرنامج بإخراج نتائج التركيب مع وظائف Gaussian ثنائية الأبعاد بالإضافة إلى إجمالي أرقام الفوتون وتجميع دقة التوطين وتشغيل عدد الأس الهيدروجيني pro.

لتوصيف عدد الفوتونات ، استخدم برنامج DL هذا لقياس متوسط عدد الفوتونات المنبعثة من النباتات. أربعة قبل تبييض الصورة لاستيراد الصورة المكتسبة وإدخال عامل التحويل من الشدة إلى رقم الفوتون. سيقوم البرنامج باكتشاف بقع الفلورسنت ، وحساب عدد الفوتون تلقائيا كدالة لرقم الإطار وإخراج آثار عدد الفوتونات.

قم بإعداد العينة لهذه التجربة عن طريق سحب 20 ميكرولترا من BSA الحيوي بمعدل واحد ملليغرام لكل مليلتر في DD H2O في غرفة العينة. احتضن لمدة 10 دقائق. اشطفها ب 30 ميكرولتر من D ddh ، وماصتين O في 0.5 ملليغرام لكل ملليلتر من الترافان المحايد واحتضانها لمدة دقيقتين.

اغسل الغرفة ب 30 ميكرولتر من M خمسة PSA. يجب إعداد الفعل لهذه التجربة في اليوم السابق كما هو موضح في نص البروتوكول. خفف الأكتين المحضر 25 مرة بشكل عام ، عازلة الأكتين إلى تركيز نهائي يبلغ حوالي 0.004 ملليغرام لكل ملليلتر.

ماصة محلول الأكتين في الغرفة وانتظر لمدة 10 دقائق. اشطف الغرفة ب 30 ميكرولترا من الميوسين المخفف المخزن المؤقت خمسة أ بعلامات العلم بمقدار 30. قم بطي المخزن المؤقت M five إلى تركيز نهائي يبلغ 250 نانو مولار.

امزج ميكرولتر واحد من الميوسين المخفف مع ميكرولتر واحد من Anti-Flag Q.Do 7 0 5. أضف ثمانية ميكرولترات من M خمسة لملء 10 ميكرولتر والماصة لأعلى ولأسفل للخلط. احتضن جيدا لمدة 10 دقائق على الجليد.

ماصة 20 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتصوير الذي يحتوي على الميوسين Q dot في غرفة العينة. احتضن لمدة ثماني إلى 10 دقائق. صور العينة على مجهر العشب عند تعريض 30 مللي ثانية.

احصل على ما لا يقل عن 1000 إطار لبدء تحليل البيانات. افتح ملف الفيديو في الصورة J واقتصاص الفيديو حول بقعة متحركة. تتبع البقعة من خلال الفيديو لإنشاء إحداثيات X و Y عبر الوقت بالبكسل من خلال تطبيق تحليل Fiona على كل إطار من الفيديو.

قم بتحويل وحدات البكسل إلى نانومتر كما هو موضح في نص البروتوكول. احسب الإزاحة من الموضع الأولي كدالة للوقت. قم بإجراء اختبار T على الإزاحة للحصول على خطوات المشي الميوسين.

احذف جميع القيم الصفرية من عمود حجم الخطوة. ارسم توزيع أحجام الخطوات باستخدام الأصل أو matlab. تناسب Gaussian على الرسم البياني.

في هذه الصورة النموذجية للسطح شل حركة SI 3D NA. يشير السهم الأصفر إلى جزيء NA ثلاثي الأبعاد SI واحد تظهر وظيفة انتشار النقطة أو PSF هنا. تم تجهيز PSF بوظيفة غاوسية ثنائية الأبعاد ، كما يتم عرض بقايا مناسبة. هذا المخطط هو أثر نموذجي لعدد الفوتون مقابل رقم الإطار ، ويعطي التركيب الأسي متوسط عدد الفوتون حوالي 1.4 في 10 إلى السادس لقياس حجم خطوة الميوسين ، وهو ملف فيديو بإشارة جيدة لضوضاء ميوسين واحد.

أثناء سيره ، يتم التقاط خيوط الأكتين. يتم عرض ثلاثة أمثلة على الإطارات. يؤدي تطبيق فيونا على كل إطار إلى مسافة مقابل تتبع زمني مرسوم باللون الأحمر.

يتم استخدام خوارزمية إيجاد الخطوات القائمة على اختبار T لاستخراج الخطوات الفردية ويتم تراكب الإخراج بأحجام الخطوات البيضاء ويتم تمييز النانومتر باللون الأبيض. عندما يتم دمج خطوات من آثار متعددة في رسم بياني ، فإن أحجام الخطوات المقاسة هي غاوسية موزعة حوالي 35.8 زائد أو ناقص 0.4 نانومتر. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إجراء تجارب Fiona ، بما في ذلك إعداد مجهر العشب لتحقيق أفضل النتائج باستخدام هذه الإجراءات ، من المهم تقليل تلف الصورة لاستخدام قوة الأرضية والتجارب.

لا تنس أن العمل مع الفحص المجهري للعشب وفيونا يمكن أن يكون خطيرا للغاية ويجب ارتداء الاحتياطات مثل نظارات السلامة أثناء تنفيذ هذا الإجراء.