عزل الحمض النووي الريبي من بنكرياس الفأر: A-ريبونوكلياز الأنسجة الغنية

الهدف العام من هذا الإجراء هو عزل الحمض النووي الريبي بسلامة عالية من بنكرياس فأر ريبونوكلياز ريدج. يتم تحقيق ذلك عن طريق إزالة البنكرياس بسرعة من جثة الفأر القتل الرحيم. بعد ذلك ، غمر البنكرياس في كاشف التحلل ، وتجانس الأنسجة.

بعد الطرد المركزي ، يتم عزل الحمض النووي الريبي من المادة الطافية باستخدام بروتوكولات قياسية ويضاف محلول مثبط الحمض النووي الريبي إلى محلول الحمض النووي الريبي النهائي. تتمثل الخطوة الأخيرة في تنظيف شفرات الخالط بعناية عن طريق إزالة أي قطع من الأنسجة العالقة في الشفرات ، ثم إجراء سلسلة من الإيثانول وغسل الماء. في النهاية ، يسمح هذا الإجراء بعزل الحمض النووي الريبي لبنكرياس الفأر برقم سلامة الحمض النووي الريبي أكبر من سبعة لاستخدامه في تحليل التعبير الجيني الروتيني.

اسمي توم شميد وأنا أعمل مع الحمض النووي الريبي لأكثر من 20 عاما ، وفي كل هذا الوقت ، لم أختبر أي شيء صعب مثل عزل الحمض النووي الريبي بنزاهة عالية لبنكرياس الفأر. تم تطوير التقنية التي سنعرضها لكم لبنكرياس الفئران ، ولكن في الحقيقة لا يوجد سبب لعدم استخدامها لمجموعة متنوعة من الأنسجة الأخرى ، بما في ذلك الأنسجة من الخلايا البشرية أو خطوط الخلايا أو الأنسجة الأخرى من الفأر ، بما في ذلك الأنسجة الغنية بنوكلياز الأضلاع مثل الطحال. سيسمح لك استخدام الاقتراحات الواردة في هذا البروتوكول بعزل الحمض النووي الريبي بسلامة عالية عن بنكرياس الفأر.

يمكن استخدام ذلك للعديد من التطبيقات النهائية مثل QPCR أو مصفوفات التعبير الجيني أو RNA-Seq. علا الجمال. سيظهر طالب دراسات عليا في مختبري هذه التقنية بعد القتل الرحيم للفأر كما هو موضح في بروتوكول النص.

قم بتأمين الذبيحة عن طريق ثقب كل بأربعة أقدام في سطح مستو باستخدام إبر تحت الجلد قياس 25 باستخدام أدوات جراحية معقمة. اقطع الجزء الأوسط من الماوس وفتح البنكرياس بسرعة من الماوس. استخدم الملقط لتثبيت البنكرياس وقطعه بعيدا عن الطحال والأمعاء الدقيقة باستخدام مقص زنبركي.

احرص على عدم شد البنكرياس أثناء إزالته من الماوس. يمكن أن يؤدي اضطراب الأنسجة إلى إطلاق الريبونوكلياز. ضع البنكرياس بالكامل في أنبوب 50 سم مكعب يحتوي على ثمانية ملليلتر من كاشف التحلل المثلج.

قم بتغطية الأنبوب ورجه لفترة وجيزة لغمر الأنسجة في الكاشف وانتقل على الفور إلى الخطوة التالية دون تأخير. بعد ذلك ، قم بتجانس البنكرياس لمدة خمس ثوان. من المهم الضغط على شفرات الخالط إلى أسفل أنبوب الطرد المركزي للسماح بسحب الأنسجة إلى الشفرات من أجل التجانس الفعال.

لإزالة الأنسجة غير المهضومة ، انقل ملليلترين من كاشف التحلل الذي يحتوي على البنكرياس المحلل إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة ملليلترتين. اجمع أنبوبين صغيرين للطرد المركزي من أجهزة الطرد المركزي المتجانسة لكل جهاز طرد مركزي معزول عند أربع درجات مئوية ، 12 ، 000 مرة جم لمدة خمس دقائق لحبيبات الأنسجة غير المهضومة. هذه خطوة حاسمة حيث من المحتمل أن يؤدي نقل الأنسجة غير المهضومة إلى المحاليل اللاحقة للحمض النووي الريبي إلى تلويث العينة بالريبونوكلياز.

نظف شفرات الخالط عن طريق وضعها في 10 مل من 70٪ إيثانول. قم بتنشيط الخالط لمدة 20 ثانية تقريبا لإزالة أي أجزاء من الأنسجة قد تكون عالقة في الشفرات. ثم استخدم طرف ماصة سعة 200 ميكرولتر لإزالة أي قطع متبقية في شفرات الخالط.

قم بتنظيف شفرات الخالط مرة أخرى في منشط تزامن الحمض النووي الريبي العام في الماء و 70٪ من الإيثانول. أخيرا ، جفف عمود الخالط بمنديل كيم نظيف. انقل ملليلتر واحد من SNA إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة ملليلترتين.

ضع جميع الأنابيب التي تحتوي على متجانس على الثلج الرطب أثناء الانتقال إلى الخطوة التالية. تابع عزل الحمض النووي الريبي على الفور وقم بتخزين أنبوب التكرار عند 80 درجة مئوية تحت الصفر لاستخدامه في المستقبل. تخلص من كاشف التحلل المتبقي في وعاء نفايات كيميائي مناسب.

يستخدم القسم التالي مجموعة تنقية الحمض النووي الريبي. تتمثل ميزة مجموعة التنقية في أنها ستعزل الحمض النووي الريبي الكلي ، بما في ذلك الحمض النووي الريبي الصغير. ابدأ العزل بإضافة 200 ميكرولتر من الكلوروفورم إلى المحلول المتجانس.

قم بتغطية الأنبوب ورجه بقوة باليد لمدة 15 ثانية. ثم اترك الأنبوب يقف في درجة حرارة الغرفة لمدة دقيقتين إلى ثلاث دقائق بعد الطرد المركزي لمدة 15 دقيقة عند 12،000 مرة جم وأربع درجات مئوية. انقل الطبقة المائية العليا إلى أنبوب طرد مركزي صغير.

أضف 1.5 كمية من الأيزوبروبانول واخلطها جيدا عن طريق سحب العينات لأعلى ولأسفل عدة مرات. انقل ما يصل إلى 700 ميكرولتر من العينة إلى عمود دوران يتم وضعه في أنبوب تجميع ملليلتر. أغلق الغطاء وجهاز الطرد المركزي عند 8,000 مرة G لمدة 15 ثانية في درجة حرارة الغرفة ثم تخلص من التدفق من خلاله.

بعد ذلك ، أضف 700 ميكرولتر من المخزن المؤقت RWT إلى عمود الدوران وجهاز الطرد المركزي. كما كان من قبل، تخلص من التدفق عبر الماصة 500 ميكرولتر من RPE العازل في عمود الدوران وجهاز الطرد المركزي مرة أخرى لغسل العمود. بعد التخلص من التدفق ، أضف 500 ميكرولتر أخرى من RPE العازل إلى جهاز الطرد المركزي لعمود الدوران لمدة دقيقتين عند 8 ، 000 مرة G.To تجفيف العمود ، انقل عمود الدوران إلى ماصة أنبوب الطرد المركزي الدقيقة سعة 1.5 ملليلتر 100 ميكرولتر من الماء الحر لنواة الضلع مباشرة على جهاز الطرد المركزي لغشاء عمود الدوران لمدة دقيقة واحدة في الساعة 8 ، 000 مرة G للتآكل ، الحمض النووي الريبي.

ثم أضف ميكرولتر واحد من مثبطات الحمض النووي الريبي إلى محلول الحمض النووي الريبي وتابع تحديد سلامة الحمض النووي الريبي باستخدام تحليل الرحلان الكهربائي الشعري كما هو موضح في مقارنة بروتوكول النص لرقم سلامة الحمض النووي الريبي أو RIN للحمض النووي الريبي المعزول من البنكرياس الفأر يكشف عن علاقة مباشرة بين حجم كاشف التحلل المستخدم في التجانس وسلامة الحمض النووي الريبي. تشير النتائج إلى أنه يجب استخدام ثمانية ملليلتر من كاشف التحلل في هذا البروتوكول ، تمت إضافة مثبط الريبونوكلياز إلى المحلول المائي للحمض النووي الريبي وتمت مقارنة سلامة الحمض النووي الريبي عند ذوبان الجليد. كان RIN لمحلول الحمض النووي الريبي مع المثبط 7.3 زائد أو ناقص 0.15 مقارنة ب 2.9 زائد أو ناقص 0.65 للمحلول الذي لا يحتوي على مثبط لفحص احتمال أن يؤدي الذوبان المتكرر بالتجميد إلى تغيير طبيعة مثبط الريبونوكلياز مما يجعله غير فعال.

تم اختبار محلول من الحمض النووي الريبي يحتوي على مثبط الريبونوكلياز. لا تزال محاليل الحمض النووي الريبي التي تم تجميدها وإذابتها حتى خمس مرات تنتج RIN سبعة أو أعلى. في حين أن تلك المحاليل التي تم تجميدها وإذابتها ست مرات أو أعلى أنتجت RIN أقل من سبعة أعداد أولية عشوائية ، تم تصنيع CDNA من الحمض النووي الريبي وتم قياس التعبير عن ثلاثة جينات للتدبير المنزلي بواسطة QPCR.

باستخدام التقنيات القياسية ، تتحقق البيانات من الاستخدام الناجح للحمض النووي الريبي للبنكرياس في الفأر في تقنية البيولوجيا الجزيئية القياسية. بمجرد التدريب بشكل صحيح ، يجب أن يكون طلاب الدراسات العليا وما بعد الدكتوراه قادرين على إكمال هذه التقنية في حوالي 30 دقيقة. وأريد فقط أن أخبركم قليلا عن كيفية استخدامناها.

نحن ندرس نماذج الفئران المعدلة وراثيا لسرطان البنكرياس ونستخدم هذه التقنية لعزل الحمض النووي الريبي. وبعد ذلك عندما نحصل على الحمض النووي الريبي ، سندرس التعبير الجيني للحمض النووي الريبي الصغير في هذه.