Name: عزل الحمض النووي الريبي من بنكرياس الفأر: A-ريبونوكلياز الأنسجة الغنية (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-08-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 47 s
Description: تعلم عزل الحمض النووي الريبي عالي الجودة من بنكرياس الفأر الغني بريبونوكلياز الأنسجة باستخدام محلول مثبط للريبونوكلياز. هذه الطريقة تضمن الحصول على رنا بدرجة نزاهة أعلى من سبعة لتحليل التعبير الجيني.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

نشكر جيان هوا لينغ، ريموند ماكدونالد، جالفين سويفت، ميشيل غريفين، بول Grippo وساتيانارايانا Rachagani الخاصة بهم مفيدة تعليقات واقتراحات وتبادل بروتوكولاتها. وأيد هذا العمل من قبل U01CA111294 منحة وجائزة تنمية فكرة من برنامج بحوث جماعية جامعة ولاية أوهايو.

1. إعداد الممارسات التالية الالتزام بالسياسات التي وضعتها لجنة رعاية الحيوان واستخدام المؤسسة ل(IACUC). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فمن المستحسن لعزل ما لا يزيد عن 6 البنكرياس الماوس في أي يوم من الأيام. لديك كل الأدوات الجراحية نظيفة وتعقيمها، مجموعة واحدة لكل حيوان. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تسمية كل أنابيب microcentrifuge. أربعة أنابيب 2 مل لكل حيوان. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع 8 مل من تحلل كاشف في 50 مل أنابيب الطرد المركزي على الجليد. ملاحظة: على الرغم من أن عدة تنقية يأتي مع ثيوسيانات الجوانيدين الفينول كاشف التي هي مناسبة لعزل البنكرياس، ويستخدم كاشف تحلل بسبب كميات كبيرة والتي هي ضرورية في العزلة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الاستغناء عن 10 مل من الحلول التالية في 15 مل أنابيب الطرد المركزي لتنظيف ريش الخالط لل. الإيثانول، 70٪ (2 أنابيب)، HPLC المياه الصف (1 أنبوب) وهبلك الصف المياه التي تحتوي على ما يقرب من 200 ميكرولتر من ريبونوكلياز بعيدا أو ما يعادلها ريبونوكلياز inactivator. </li></oل&gt; 2. جراحة، تشريح البنكرياس والتجانس <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع 1-2 مل من isoflurane وإلى جرة تحتوي على شاش القطن أو المناشف الورقية. يتم وضع الفئران على منصة يمنعهم من الوصول إلى مصدر isoflurane و. إضافة جديدة لisoflurane والجرة قبل التخدير لكل الماوس. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع الماوس بلطف في جرة تحتوي على isoflurane و. سقف الجرة ورصد آثار التخدير عن طريق تناوب بلطف الجرة ذهابا وإيابا. يتم تخدير الحيوان مرة واحدة هو في غير قادر على الوقوف في &#39;الخاصة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> للحصول على تأكيد من التخدير، وإزالة الحيوان من الجرة وتطبيق قرصة أخمص القدمين الشركة. إذا لا تتفاعل الماوس إلى قرصة أخمص القدمين، انتقل إلى الخطوة 2.5. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إذا يتفاعل الماوس إلى قرصة أخمص القدمين، ثم كرر الخطوات من 2،2-2،3. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع الحيوان تخدير على أعلى مقاعد البدلاء في وضعية الانبطاح. خلخل عنق الرحم الماوس، عن طريق وضع بإحكام اليد اليسرى على عنق الرحم الفأر. لناجي اليد اليمنى فهم ذيل الماوس، وبسرعة سحب صعودا في حوالي بزاوية 45 درجة الى خلخل عنق الرحم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تأمين الذبيحة على سطح (قطعة من الستايروفوم مستوى مغطاة المناشف الورقية) من خلال ثقب كل أربعة الكفوف الحيوان في سطح مستو باستخدام قياس 25 إبر الحقن. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام الأدوات الجراحية المعقمة، وقطع القسم الوسطي من الفأرة مفتوحة وبسرعة إزالة البنكرياس من الماوس. استخدام ملقط لعقد البنكرياس وقطع عليه من الطحال والأمعاء الدقيقة باستخدام مقص الربيع. يجب الحرص على عدم تمتد البنكرياس خلال إزالة من الماوس. تعطيل الأنسجة قد يفرج عن ريبونوكلياز. ملاحظة: إن الوقت الذي يستغرقه لإزالة البنكرياس من الماوس أمر بالغ الأهمية. وينبغي أن يكون الشخص قادرا على المهرة تشريح البنكرياس في حوالي 1 دقيقة أو أقل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع البنكرياس بأكمله في أنبوب 50 مل تحتوي على 8 مل من الجليد الباردة كاشف تحلل. غطاء الأنبوب لفترة وجيزة يهز لتزج منظمة الشفافية الدوليةssue في كاشف والمضي قدما إلى الخطوة التالية دون تأخير. نسبة تحلل الأنسجة كاشف لأمر بالغ الأهمية. راجع قسم نتائج مقارنة لسلامة الحمض النووي الريبي معزولة باستخدام كميات مختلفة من تحلل كاشف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التجانس لمدة 5 ثوانى. فمن المهم للضغط على شفرات الخالط إلى الجزء السفلي من أنبوب الطرد المركزي للسماح للأنسجة ليتم سحبها في شفرات لتجانس كفاءة. </li></ol> 3. إزالة الأنسجة غير المهضومة ملاحظة: بعد التجانس، وقطع صغيرة من الأنسجة البقاء في كاشف تحلل. هو أكثر أهمية لليز بسرعة الأنسجة ترك بعض الأنسجة عسر الهضم بدلا من أكثر من المجانسة وتدهور خطر الحمض النووي الريبي. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل 2 مل من كاشف تحلل تحتوي على البنكرياس هي lysed إلى أنبوب microcentrifuge 2 مل. جمع اثنين من أنابيب microcentrifuge جناسة في العزلة. تجاهل جناسة المتبقية أو تخزينها في -80 درجة مئوية لمدة الدراسات المستقبلية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> سنتrifuge في 4 درجات مئوية، 12،000 × ز لمدة 5 دقائق لبيليه الأنسجة عسر الهضم. هذا هو خطوة حاسمة كما المرحل من الأنسجة غير مهضوم إلى حلول لاحقة من الحمض النووي الريبي من المرجح أن تلوث العينة مع ريبونوكلياز (الخطوة 5.13). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل 1 مل من طاف في أنبوب microcentrifuge 2 مل. المضي قدما في عزلة فورا وتخزين أنبوب تكرار في -80 درجة مئوية لاستخدامها في المستقبل. وضع جميع الأنابيب التي تحتوي على جناسة على الجليد الرطب في حين الشروع في الخطوة التالية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التخلص من المتبقي تحلل كاشف إلى وعاء النفايات الكيميائية المناسبة. </li></ol> 4 تنظيف من ريش الخالط <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قبل الانتقال إلى العزلة المقبل، وتنظيف ريش الخالط عن طريق وضعها في 10 مل من الايثانول 70٪. تفعيل الخالط لمدة 20 ثانية لإزالة أي قطع من الأنسجة التي يمكن اصطيادها في ريش. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام غيض 200 ميكرولتر الماصة لإزالة أي القطع التي تبقى في ريش الخالط. </lط&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> كرر الخطوة 4.1 في الماء، العام ريبونوكلياز inactivator والايثانول 70٪. تجفيف رمح الخالط مع كيم يمسح نظيفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كرر الخطوة 2.1 لعزل البنكرياس من الحيوانات المتبقية، وحفظ الحمض النووي الريبي معزولة عن كل حيوان منفصلة بدلا من تجميع الحمض النووي الريبي. </li></ol> 5. عزل الحمض النووي الريبي المقطع التالي هو مطابق لبروتوكول طقم تنقية. الاستفادة من عدة تنقية هو أنه سوف عزل الحمض النووي الريبي مجموع بما في ذلك الرنا الصغيرة. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إذا باستخدام الحل جناسة المجمدة، وذوبان الجليد على الجليد الرطب واسمحوا الوقوف على RT لمدة 5 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 200 ميكرولتر من كلوروفورم، وكأب أنبوب ويهز بقوة باليد لمدة 15 ثانية. السماح للأنبوب الوقوف على RT لمدة 2-3 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أجهزة الطرد المركزي لمدة 15 دقيقة في 12،000 x ج، 4 درجات مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل الطبقة المائية العليا في أنبوب microcentrifuge. إضافة 1.5 حجم الأيزوبروبانول ومزيج دقيق من قبل pipetting صعودا وهبوطا عدة مرات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل ما يصل الى 700 ميكرولتر من العينة في عمود الدوران التي يتم وضعها في أنبوب جمع 2 مل. إغلاق الغطاء وأجهزة الطرد المركزي في 8000 x ج لمدة 15 ثانية في RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تجاهل التدفق من خلال. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كرر الخطوات من 5،5-5،6، وذلك باستخدام ما تبقى من العينة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 700 ميكرولتر العازلة RWT إلى عمود الدوران. أجهزة الطرد المركزي لمدة 15 ثانية في 8،000 ز س. تجاهل التدفق من خلال. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الماصة 500 ميكرولتر العازلة RPE في العمود تدور. أجهزة الطرد المركزي لمدة 15 ثانية في 8000 x ج لغسل العمود. تجاهل التدفق من خلال. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 500 ميكرولتر العازلة RPE إلى عمود الدوران. أجهزة الطرد المركزي لمدة 2 دقيقة في 8،000 x ج لتجف العمود. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل عمود الدوران إلى أنبوب microcentrifuge 1.5 مل. الماصة 80 ميكرولتر ريبونوكلياز خالية من المياه مباشرة على غشاء عمود الدوران. أجهزة الطرد المركزي لمدة 1 دقيقة في 8،000 x ج لأزل الحمض النووي الريبي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 1 ميكرولتر ريبونوكلياز المانع في حل الحمض النووي الريبي. تخزين في -80 درجة مئوية أو الشروع في 5.13. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> للتحقق من صحة سلامة الحمض النووي الريبي، وحساب لأول مرة بغية دراسته واقراره الحمض النووي الريبيntration و260/280 نسبة استخدام الطيف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تمييع جزء من الحل RNA إلى ما يقرب من 500 نانوغرام / ميكرولتر مع البيولوجيا الجزيئية المياه الصف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحديد النزاهة الحمض النووي الريبي (أي رين) باستخدام التحليل الكهربائي الشعري. حوالي 5 ميكرولتر من محلول الحمض النووي الريبي كافية للتحليل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قسامة الحل الحمض النووي الريبي (انظر الشكل 2) وتخزينها في -80 درجة مئوية. </li></ol>

<ol><li>Chen, C., Ridzon, D. A., Broomer, A. J., Zhou, Z., Lee, D. H., Nguyen, J. T., Barbisin, M., Xu, N. L., Mahuvakar, V. R., Andersen, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+quantification+of+microRNAs+by+stem-loop+RT-PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Real-time quantification of microRNAs by stem-loop RT-PCR.</a> Nucleic Acids Res. 33, e179(2005).</li>
<li>Chirgwin, J. M., Przybyla, A. E., MacDonald, R. J., Rutter, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+biologically+active+ribonucleic+acid+from+sources+enriched+in+ribonuclease%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Isolation of biologically active ribonucleic acid from sources enriched in ribonuclease.</a> Biochemistry. 18, 5294-5299 (1979).</li>
<li>Chomczynski, P., Sacchi, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-step+method+of+RNA+isolation+by+acid+guanidinium+thiocyanate-phenol-chloroform+extraction%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction.</a> Anal Biochem. 162, 156-159 (1987).</li>
<li>Griffin, M., Abu-El-Haija, M., Abu-El-Haija, M., Rokhlina, T., Uc, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simplified+and+versatile+method+for+isolation+of+high-quality+RNA+from+pancreas%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Simplified and versatile method for isolation of high-quality RNA from pancreas.</a> Biotechniques. 52, 332-334 (2012).</li>
<li>Iyer, V. R., Eisen, M. B., Ross, D. T., Schuler, G., Moore, T., Lee, J. C., Trent, J. M., Staudt, L. M., Hudson Jr, J., Boguski, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+transcriptional+program+in+the+response+of+human+fibroblasts+to+serum%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The transcriptional program in the response of human fibroblasts to serum.</a> Science. 283, 83-87 (1999).</li>
<li>Lenstra, J. A., Beintema, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+amino+acid+sequence+of+mouse+pancreatic+ribonuclease.+Extremely+rapid+evolutionary+rates+of+the+myomorph+rodent+ribonucleases%5BTitle%5D)+AND+%22European+journal+of+biochemistry++FEBS%22%5BJournal%5D)">The amino acid sequence of mouse pancreatic ribonuclease. Extremely rapid evolutionary rates of the myomorph rodent ribonucleases.</a> European journal of biochemistry FEBS. 98, 399-408 (1979).</li>
<li>Mullin, A. E., Soukatcheva, G., Verchere, C. B., Chantler, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+in+situ+ductal+perfusion+to+facilitate+isolation+of+high-quality+RNA+from+mouse+pancreas%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Application of in situ ductal perfusion to facilitate isolation of high-quality RNA from mouse pancreas.</a> Biotechniques. 40, 617-621 (2006).</li>
<li>Rio, D. C., Ares, M., Hannon, G. J., Nilsen, T. W. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRio%2C+DC+%22RNA+A+Laboratory+Manual%22">RNA A Laboratory Manual</a>. , Cold Springs Harbor Laboratory Press. Cold Springs Harbor, NY. (2011).</li>
<li>Streit, S., Michalski, C. W., Erkan, M., Kleeff, J., Friess, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Northern+blot+analysis+for+detection+and+quantification+of+RNA+in+pancreatic+cancer+cells+and+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Northern blot analysis for detection and quantification of RNA in pancreatic cancer cells and tissues.</a> Nat Protoc. 4, 37-43 (2009).</li>
<li>Zmuda, E. J., Powell, C. A., Hai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+murine+islet+isolation+and+subcapsular+kidney+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments++JoVE%22%5BJournal%5D)">A method for murine islet isolation and subcapsular kidney transplantation.</a> Journal of Visualized Experiments JoVE. , (2011).</li>
</ol>

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

عزل الحمض النووي الريبي من الأنسجة التي يتم ريبونوكلياز الغنية يمثل تحديا كبيرا للتجارب البيولوجيا الجزيئية. والمتاحة تجاريا التي تستند الكواشف المختلفة ومجموعات في المقام الأول على طريقة الفينول الجوانيدين ثيوسيانات من استخراج الحمض النووي الريبي. الجوانيدين ثيوسيانات يبدل طبيعة البروتين وبالتالي يقلل من نشاط ريبونوكلياز. ومع ذلك، فإن ضخامة ريبونوكلياز في البنكرياس يتطلب تعديلات إضافية على البروتوكولات القياسية للعزل الحمض النووي الريبي. وتفيد التقارير بروتوكول هنا أن يتم على أسا...

مطلوب عزل الحمض النووي الريبي مع سلامة عالية للروتين تجارب البيولوجيا الجزيئية مثل شمال النشاف 9، QRT-PCR 1 أو التعبير الجيني التنميط 5. وتستند معظم الطرق المعاصرة لعزل الحمض النووي الريبي على إدخال تعديلات على البروتوكولات ثيوسيانات الجوانيدين 2، 3. الجوانيدين ثيوسيانات هو ممسخ بروتين قوي وفعال وتعطيل نشاط ريبونوكلياز في معظم الظروف. طريقة شعبية من Chomczynski وساكي 3 مجتمعة الفينول في حل الجوانيدين ثيوسيانات تحلل، مما يقلل من الوقت العزلة إلى حوالي 4 ساعة. وتقوم العديد من الكواشف المتاحة تجاريا استخراج الحمض النووي الريبي على Chomczynski وطريقة ساكي 3. الأنسجة الغنية ريبونوكلياز مثل الإنسان أو الماوس البنكرياس يمثل تحديا إضافيا لعزل الحمض النووي الريبي. قد تحتوي الماوس البنكرياس تصل إلى 75 ملغ من ريبونوكلياز 6 سيصدر بعضها الزيتوز تعطيل الأنسجة البنكرياس مما يؤدي إلى انحلال ذاتي الأنسجة. وقد استخدمت التعديلات على البروتوكولات الجوانيدين ثيوسيانات بنجاح لعزل الحمض النووي الريبي من البنكرياس مع سلامة عالية 2، 4، 7، 10. التسريب من الحمض النووي الريبي لتحقيق الاستقرار في الماوس كاشف البنكرياس العزلة سهلت من الحمض النووي الريبي مع سلامة عالية 4، 7، 10، ولكن ضخ الحلول في البنكرياس يتطلب مهارة كبيرة، قد تتطلب أدوات متخصصة مثل مجهر تشريح وتعطيل العمارة الأنسجة أثناء إجراء قد يؤدي إلى تحلل الخلايا. Perfusing الأنسجة مع تثبيت الحمض النووي الريبي كاشف قد تتداخل مع غيرها من التطبيقات بما في ذلك عزل البروتين وتلطيخ النسيجية. علاوة على ذلك، هذه التقنية ليست مناسبة لعزل الحمض النووي الريبي من البنكرياس الإنسان. بروتوكولات أخرى تتطلب إعداد حلول محددة من قبل المحقق 2. نفيدكم بروتوكول لعزل الحمض النووي الريبي مع سلامة عالية من الماوس البنكرياس. اليستخدم بروتوكول البريد عناصر الأساليب المنشورة سابقا، ويستند إلى حد كبير على الفينول / جوانيداين تحلل بروتوكولات كاشف القائم على ثيوسيانات القياسية. أنها لا تتطلب إعداد الحلول المتخصصة كما أنها لا تتطلب ضخ الكواشف في البنكرياس. وتشمل الخطوات الحاسمة لنجاح عزل الحمض النووي الريبي عالية الفينول / القائم جوانيداين تحلل كاشف إلى نسبة الأنسجة، وإزالة الأنسجة غير مهضوم قبل مرحلة الانفصال وإدراج المانع ريبونوكلياز إلى حل RNA الناتجة عن ذلك. باستخدام هذه التعديلات وغيرها، ونحن عادة عزل الحمض النووي الريبي مع رين أكبر من 7 لاستخدامها في تحليل التعبير الجيني الروتينية.

<table><tbody><tr><td>باور جين 500 &nbsp;</td><td>فيشر ساينتفيك</td><td>14-261-03&nbsp;</td><td>الخالط</td></tr><tr><td>5424R</td><td>Eppendorf</td><td></td><td>المبردة الطرد المركزي</td></tr> الدقيق <tr><td>كاشف Trizol</td><td>Invitrogen</td><td>15596018</td><td>كاشف التحلل</td></tr><tr><td>الطالب Vannas الربيع مقص</td><td>فيشر</td><td>91500-09 &nbsp;</td><td>يستخدم لقطع البنكرياس من الأنسجة المرفقة</td></tr><tr><td>مقص جراحي ، 6 بوصات</td><td>فيشر</td><td>08-951-20</td><td>استخدم لقطع ملقط نهاية الفأر</td></tr><tr><td></td><td>الحاد فيشر</td><td>1381239</td><td>استخدم لعقد البنكرياس أثناء تشريح</td></tr><tr><td>Isoflurane USP</td><td>Abbott Labs</td><td>4/8/5210</td><td>Anesthetic</td></tr><tr><td>Rnase out (40 U/&micro; ل)</td> <td>Invitrogen</td><td>10777-019</td><td>Rnase inhbitor</td></tr><tr><td>Rnase Away</td><td>Ambion</td><td>10328-011</td><td>عام معطل Rnase معطل</td></tr><tr><td>HPLC درجة المياه</td><td>فيشر</td><td>W5-4</td><td>لغسل شفرات الخالط</td></tr><tr><td>المياه بدرجة البيولوجيا الجزيئية</td><td>Hyclone</td><td>SH30538.03</td><td>شطف الحمض النووي الريبي</td></tr><tr><td>miRNeasy مجموعة صغيرة</td><td>Qiagen</td><td>217004</td><td>Purification</td></tr> <tr><td>Kit2 مل أنابيب الطرد المركزي الدقيقة ، معتمدة من Rnase Dnase الحرة</td><td>من الولايات المتحدة الأمريكية Scientific Plastics</td><td>1620-2700</td><td></td></tr><tr><td>15 مل أنابيب الطرد المركزي</td><td>Falcon</td><td>352099</td><td></td></tr><tr><td>70٪ إيثانول</td><td>فيشر</td><td></td><td></td></tr><tr><td>100٪ إيثانول</td><td>فيشر</td><td></td><td></td></tr><tr><td>200 & مايكرو ؛ ل نصائح الماصة</td><td>Rainin</td><td>GPL200F</td><td>لتنظيف شفرات الخالط</td></tr><tr><td>الكلوروفورم</td><td>فيشر</td><td>BP1145-1</td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop</td><td>Thermo</td><td>ND-1000</td> مقياس <td>الطيف الضوئي</td></tr><tr><td>المحلل الحيوي</td><td>محلل الرحلان الكهربائي الشعري الرشيق لقياس سلامة الحمض النووي</td><td></td> الريبي RNAlater Ambion RNA Stabilization Reagent&nbsp ؛<td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>RNeasy&nbsp; أعمدة الدوران&nbsp;</td><td>أعمدة Qiagen</td><td></td><td>Spin&nbsp; كجزء من مجموعة miRNeasy Mini</td></tr><tr><td>Mice</td><td>Chales River</td><td>Strain C57BL / 6</td><td>تراوح أعمارهم من 4 إلى 12 شهرا. &nbsp;</td></tr><tr><td>الفئران&nbsp;</td>سلالة <td>جاكسون لاب</td><td>129</td><td>تراوحت أعمارهم من 4 إلى 12 شهرا. &nbsp;</td></tr></tbody></table>

عزل الحمض النووي الريبي من بنكرياس الفأر: a-ريبونوكلياز الأنسجة الغنية

RNA Isolation from Mouse Pancreas: A Ribonuclease-rich Tissue

يمثل عزل الحمض النووي الريبي عالي الجودة عن الأنسجة الغنية بالريبونوكلياز مثل بنكرياس الفأر تحديا. نظرا لأن الوظيفة الأساسية للبنكرياس هي المساعدة في الهضم ، فقد يحتوي البنكرياس الفأر على 75 مجم من الريبونوكلياز. أبلغنا عن تعديلات على بروتوكولات كاشف تحلل الفينول / الجوانيدين ثيوسيانات القياسية لعزل الحمض النووي الريبي من بنكرياس الفأر. ثيوسيانات جوانيدين هو ممسخ قوي للبروتين وسيعطل بشكل فعال نشاط الريبونوكلياز في معظم الظروف. ومع ذلك ، فإن التعديلات الهامة على البروتوكولات القياسية ضرورية لعزل الحمض النووي الريبي بنجاح عن الأنسجة الغنية بالريبونوكلياز. تشمل الخطوات الرئيسية نسبة كاشف التحلل إلى الأنسجة العالية ، وإزالة الأنسجة غير المهضومة قبل فصل الطور وإدراج مثبط الريبونوكلياز في محلول الحمض النووي الريبي. باستخدام هذه التعديلات وغيرها ، نقوم بشكل روتيني بعزل الحمض النووي الريبي برقم سلامة الحمض النووي الريبي (RIN) أكبر من 7. الحمض النووي الريبي المعزول ذو جودة مناسبة لتحليل التعبير الجيني الروتيني. يجب أن يكون تكييف هذا البروتوكول لعزل الحمض النووي الريبي من الأنسجة الغنية بالريبونوكلياز إلى جانب البنكرياس قابلا للتحقيق بسهولة.

مجموع العائد الحمض النووي الريبي من 1 مل من تحلل جناسة هو 20-40 ميكروغرام. OD 260/280 نسب هي عادة حوالي 2.0 ورين أكبر باستمرار من 7.0. إذا كان رين و≤ 6، سيتعين على العزلة أن تتكرر. في بعض الأحيان، وحقق رين الذي هو أعلى من 8.0. طريقتين الأكثر استخداما القتل الرحيم الفئران قبل إزالة البنكرياس هي CO 2 الاختناق أو استنشاق isoflurane و. ويتبع كل من التقنيات من قبل خلع عنق الرحم. نظرا لأنه من الممكن أن يكون ...

أبلغنا عن إجراء لعزل الحمض النووي الريبي ذو السلامة العالية من بنكرياس الفأر الغني بالريبونوكلياز.

عزل الحمض النووي الريبي من بنكرياس الفأر: A-ريبونوكلياز الأنسجة الغنية

Isolation of high-quality RNA from ribonuclease-rich tissue such as mouse pancreas presents a challenge.  As a primary function of the pancreas is to aid ...

الهدف العام من هذا الإجراء هو عزل الحمض النووي الريبي بسلامة عالية من بنكرياس فأر ريبونوكلياز ريدج. يتم تحقيق ذلك عن طريق إزالة البنكرياس بسرعة من جثة الفأر القتل الرحيم. بعد ذلك ، غمر البنكرياس في كاشف التحلل ، وتجانس الأنسجة.بعد الطرد المركزي ، يتم عزل الحمض النووي الريبي من المادة الطافية باستخدام بروتوكولات قياسية ويضاف محلول مثبط الحمض النووي الريبي إلى محلول الحمض النووي الريبي النهائي. تتمثل الخطوة الأخيرة في تنظيف شفرات الخالط بعناية عن طريق إزالة أي قطع من الأنسجة العالقة في الشفرات ، ثم إجراء سلسلة من الإيثانول وغسل الماء. في النهاية ، يسمح هذا الإجراء بعزل الحمض النووي الريبي لبنكرياس الفأر برقم سلامة الحمض النووي الريبي أكبر من سبعة لاستخدامه في تحليل التعبير الجيني الروتيني.اسمي توم شميد وأنا أعمل مع الحمض النووي الريبي لأكثر من 20 عاما ، وفي كل هذا الوقت ، لم أختبر أي شيء صعب مثل عزل الحمض النووي الريبي بنزاهة عالية لبنكرياس الفأر. تم تطوير التقنية التي سنعرضها لكم لبنكرياس الفئران ، ولكن في الحقيقة لا يوجد سبب لعدم استخدامها لمجموعة متنوعة من الأنسجة الأخرى ، بما في ذلك الأنسجة من الخلايا البشرية أو خطوط الخلايا أو الأنسجة الأخرى من الفأر ، بما في ذلك الأنسجة الغنية بنوكلياز الأضلاع مثل الطحال. سيسمح لك استخدام الاقتراحات الواردة في هذا البروتوكول بعزل الحمض النووي الريبي بسلامة عالية عن بنكرياس الفأر.يمكن استخدام ذلك للعديد من التطبيقات النهائية مثل QPCR أو مصفوفات التعبير الجيني أو RNA-Seq. علا الجمال. سيظهر طالب دراسات عليا في مختبري هذه التقنية بعد القتل الرحيم للفأر كما هو موضح في بروتوكول النص.قم بتأمين الذبيحة عن طريق ثقب كل بأربعة أقدام في سطح مستو باستخدام إبر تحت الجلد قياس 25 باستخدام أدوات جراحية معقمة. اقطع الجزء الأوسط من الماوس وفتح البنكرياس بسرعة من الماوس. استخدم الملقط لتثبيت البنكرياس وقطعه بعيدا عن الطحال والأمعاء الدقيقة باستخدام مقص زنبركي.احرص على عدم شد البنكرياس أثناء إزالته من الماوس. يمكن أن يؤدي اضطراب الأنسجة إلى إطلاق الريبونوكلياز. ضع البنكرياس بالكامل في أنبوب 50 سم مكعب يحتوي على ثمانية ملليلتر من كاشف التحلل المثلج.قم بتغطية الأنبوب ورجه لفترة وجيزة لغمر الأنسجة في الكاشف وانتقل على الفور إلى الخطوة التالية دون تأخير. بعد ذلك ، قم بتجانس البنكرياس لمدة خمس ثوان. من المهم الضغط على شفرات الخالط إلى أسفل أنبوب الطرد المركزي للسماح بسحب الأنسجة إلى الشفرات من أجل التجانس الفعال.لإزالة الأنسجة غير المهضومة ، انقل ملليلترين من كاشف التحلل الذي يحتوي على البنكرياس المحلل إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة ملليلترتين. اجمع أنبوبين صغيرين للطرد المركزي من أجهزة الطرد المركزي المتجانسة لكل جهاز طرد مركزي معزول عند أربع درجات مئوية ، 12 ، 000 مرة جم لمدة خمس دقائق لحبيبات الأنسجة غير المهضومة. هذه خطوة حاسمة حيث من المحتمل أن يؤدي نقل الأنسجة غير المهضومة إلى المحاليل اللاحقة للحمض النووي الريبي إلى تلويث العينة بالريبونوكلياز.نظف شفرات الخالط عن طريق وضعها في 10 مل من 70٪ إيثانول. قم بتنشيط الخالط لمدة 20 ثانية تقريبا لإزالة أي أجزاء من الأنسجة قد تكون عالقة في الشفرات. ثم استخدم طرف ماصة سعة 200 ميكرولتر لإزالة أي قطع متبقية في شفرات الخالط.قم بتنظيف شفرات الخالط مرة أخرى في منشط تزامن الحمض النووي الريبي العام في الماء و 70٪ من الإيثانول. أخيرا ، جفف عمود الخالط بمنديل كيم نظيف. انقل ملليلتر واحد من SNA إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة ملليلترتين.ضع جميع الأنابيب التي تحتوي على متجانس على الثلج الرطب أثناء الانتقال إلى الخطوة التالية. تابع عزل الحمض النووي الريبي على الفور وقم بتخزين أنبوب التكرار عند 80 درجة مئوية تحت الصفر لاستخدامه في المستقبل. تخلص من كاشف التحلل المتبقي في وعاء نفايات كيميائي مناسب.يستخدم القسم التالي مجموعة تنقية الحمض النووي الريبي. تتمثل ميزة مجموعة التنقية في أنها ستعزل الحمض النووي الريبي الكلي ، بما في ذلك الحمض النووي الريبي الصغير. ابدأ العزل بإضافة 200 ميكرولتر من الكلوروفورم إلى المحلول المتجانس.قم بتغطية الأنبوب ورجه بقوة باليد لمدة 15 ثانية. ثم اترك الأنبوب يقف في درجة حرارة الغرفة لمدة دقيقتين إلى ثلاث دقائق بعد الطرد المركزي لمدة 15 دقيقة عند 12،000 مرة جم وأربع درجات مئوية. انقل الطبقة المائية العليا إلى أنبوب طرد مركزي صغير.أضف 1.5 كمية من الأيزوبروبانول واخلطها جيدا عن طريق سحب العينات لأعلى ولأسفل عدة مرات. انقل ما يصل إلى 700 ميكرولتر من العينة إلى عمود دوران يتم وضعه في أنبوب تجميع ملليلتر. أغلق الغطاء وجهاز الطرد المركزي عند 8,000 مرة G لمدة 15 ثانية في درجة حرارة الغرفة ثم تخلص من التدفق من خلاله.بعد ذلك ، أضف 700 ميكرولتر من المخزن المؤقت RWT إلى عمود الدوران وجهاز الطرد المركزي. كما كان من قبل، تخلص من التدفق عبر الماصة 500 ميكرولتر من RPE العازل في عمود الدوران وجهاز الطرد المركزي مرة أخرى لغسل العمود. بعد التخلص من التدفق ، أضف 500 ميكرولتر أخرى من RPE العازل إلى جهاز الطرد المركزي لعمود الدوران لمدة دقيقتين عند 8 ، 000 مرة G.To تجفيف العمود ، انقل عمود الدوران إلى ماصة أنبوب الطرد المركزي الدقيقة سعة 1.5 ملليلتر 100 ميكرولتر من الماء الحر لنواة الضلع مباشرة على جهاز الطرد المركزي لغشاء عمود الدوران لمدة دقيقة واحدة في الساعة 8 ، 000 مرة G للتآكل ، الحمض النووي الريبي.ثم أضف ميكرولتر واحد من مثبطات الحمض النووي الريبي إلى محلول الحمض النووي الريبي وتابع تحديد سلامة الحمض النووي الريبي باستخدام تحليل الرحلان الكهربائي الشعري كما هو موضح في مقارنة بروتوكول النص لرقم سلامة الحمض النووي الريبي أو RIN للحمض النووي الريبي المعزول من البنكرياس الفأر يكشف عن علاقة مباشرة بين حجم كاشف التحلل المستخدم في التجانس وسلامة الحمض النووي الريبي. تشير النتائج إلى أنه يجب استخدام ثمانية ملليلتر من كاشف التحلل في هذا البروتوكول ، تمت إضافة مثبط الريبونوكلياز إلى المحلول المائي للحمض النووي الريبي وتمت مقارنة سلامة الحمض النووي الريبي عند ذوبان الجليد. كان RIN لمحلول الحمض النووي الريبي مع المثبط 7.3 زائد أو ناقص 0.15 مقارنة ب 2.9 زائد أو ناقص 0.65 للمحلول الذي لا يحتوي على مثبط لفحص احتمال أن يؤدي الذوبان المتكرر بالتجميد إلى تغيير طبيعة مثبط الريبونوكلياز مما يجعله غير فعال.تم اختبار محلول من الحمض النووي الريبي يحتوي على مثبط الريبونوكلياز. لا تزال محاليل الحمض النووي الريبي التي تم تجميدها وإذابتها حتى خمس مرات تنتج RIN سبعة أو أعلى. في حين أن تلك المحاليل التي تم تجميدها وإذابتها ست مرات أو أعلى أنتجت RIN أقل من سبعة أعداد أولية عشوائية ، تم تصنيع CDNA من الحمض النووي الريبي وتم قياس التعبير عن ثلاثة جينات للتدبير المنزلي بواسطة QPCR.باستخدام التقنيات القياسية ، تتحقق البيانات من الاستخدام الناجح للحمض النووي الريبي للبنكرياس في الفأر في تقنية البيولوجيا الجزيئية القياسية. بمجرد التدريب بشكل صحيح ، يجب أن يكون طلاب الدراسات العليا وما بعد الدكتوراه قادرين على إكمال هذه التقنية في حوالي 30 دقيقة. وأريد فقط أن أخبركم قليلا عن كيفية استخدامناها.نحن ندرس نماذج الفئران المعدلة وراثيا لسرطان البنكرياس ونستخدم هذه التقنية لعزل الحمض النووي الريبي. وبعد ذلك عندما نحصل على الحمض النووي الريبي ، سندرس التعبير الجيني للحمض النووي الريبي الصغير في هذه.

rna-isolation-from-mouse-pancreas-a-ribonuclease-rich-tissue

Research

JoVE Journal

Biology

علم الأحياء

فأري عزل جزيرة البنكرياس

يوصف وصفا مفصلا لعزل جزيرة الماوس باستخدام تقنية في كيفية تركيب الكانيولا في البنكرياس القنوي الموقع ونضح من مجموعة من تنقية الأنزيم البروتيني كولاجيناز ومحايدة.

الماوس جزيرة من العزلة انجرهانز باستخدام مزيج من كولاجيناز تنقية والبروتياز متعادلة

نقدم هنا بروتوكولا لعزل الجزر الصغيرة عن نموذج الفأر لمرض السكري من النوع 2 ، Leprdb وتفاصيل اختبار الخلايا الحية لقياس إفراز الأنسولين من الجزر السليمة التي تستخدم 2 مجهر فوتون.

Lepr<sup&gt; ديسيبل</sup&gt; نموذج الفأر من النوع 2 من مرض السكري: البنكرياس عزل جزيرة وتعيش خلية 2 فوتون التصوير من الجزر سليمة

في المقايسات مستعمرة المختبر للكشف عن تجديد الذات والتمايز للخلايا السلف عزل من البنكرياس الفئران الكبار وضعها. في هذه المقايسات، الأسلاف البنكرياس تؤدي إلى مستعمرات الخلايا في الفضاء 3 الابعاد في المتوسطة التي تحتوي على ميثيل شبه صلبة. ووصف بروتوكولات للتعامل مع الخلايا وحيدة وتوصيف المستعمرات الفردية.

في المختبر مستعمرة فحوصات للتميز الخلايا السلف ثلاثي قوية المعزولة من الفئران البنكرياس الكبار

نحن تصف بروتوكول هنا لعزل الجزر سليمة من الفئران حديثي الولادة. تم هضمها بنكرياسات جزئيا مع كولاجيناز، تليها الغسيل وقطف اليد. ويمكن الحصول على 80 مجموعات جزيرة في البنكرياس من الفئران الوليدة، والتي هي مناسبة لعدة دراسات خلايا البنكرياس - 20.

عزل فعال من الجزر وظيفية من الأطفال حديثي الولادة البنكرياس ماوس

وصف بروتوكول عزل الجزيرة هذا مسارًا جديدًا لحقن الكولاجين لهضم الأنسجة الخارجية وإجراء تدرج مبسط لتنقية الجزر من الفئران. وهو ينطوي على الهضم الأنزيمي، فصل التدرج / تنقية، ومجموعة انتقاء اليد. يمكن أن ينتج عن العزل الناجح 250-350 جزيرة عالية الجودة وكاملة التشغيل لكل ماوس.

بروتوكول بسيط عالي الكفاءة لعزل الجزيرة البنكرياسية عن الفئران

يصف لنا طريقة لعزل خلايا الغدد الصماء من البنكرياس الأجنة والأطفال حديثي الولادة وبعد الولادة، تليها تسلسل الحمض النووي الريبي خلية واحدة. يسمح هذا الأسلوب بتحليل التنمية النسب الغدد الصماء في البنكرياس، خلية ديناميات عدم التجانس وترانسكريبتوميك.

تحليلات ترانسكريبتوميك خلية واحدة من خلايا الغدد الصماء البنكرياس الماوس

هنا ، نصف الترسيب المناعي للريبوسوم والحمض النووي الريبي المرتبط به من مجموعات مختارة من الخلايا الجرثومية الذكور الذكور البالغين باستخدام نظام RiboTag. التربية الاستراتيجية والتناهيال المناعة دقيق يؤدي إلى نتائج نظيفة، قابلة للاستنساخ التي تبلغ عن الترجمة الخلية الجرثومية وتوفير نظرة ثاقبة في آليات الظواهر المتحولة.

الترسيب المناعي للريبوسوتاغ في الخلايا الجرثومية للفأر الذكر

نقاء وسلامة الجيش الملكي النيبالي المعزول هو خطوة حيوية في اختبار الحمض النووي الريبي تعتمد. هنا، نقدم طريقة عملية وسريعة وغير مكلفة لاستخراج الحمض النووي الريبي من كمية صغيرة من أنسجة البنكرياس غير التالفة.

استخراج RNA سريع وفعال من حيث التكلفة من أنسجة البنكرياس الجرذ

يصف هذا البروتوكول عزل الخلايا البطانية للفأر عن البنكرياس الكامل.

عزل الخلايا البطانية البنكرياسية للفأر

طورت هذه الدراسة طريقة مبسطة لاستخراج الجزر الأولية الوظيفية والخلايا الأسينارية بكفاءة من بنكرياس الفأر، مما يوفر أداة قيمة لدراسة التواصل بين الخلايا في مسببات مرض السكري الحاد الناتج عن التهاب البنكرياس.

طريقة بسيطة وسريعة للعزل المتزامن للجزر الأولية وخلايا البنكرياس الأولية من الفئران

تعلم عزل الحمض النووي الريبي عالي الجودة من بنكرياس الفأر الغني بريبونوكلياز الأنسجة باستخدام محلول مثبط للريبونوكلياز. هذه الطريقة تضمن الحصول على رنا بدرجة نزاهة أعلى من سبعة لتحليل التعبير الجيني.

عزل الحمض النووي الريبي من بنكرياس الفأر: A-ريبونوكلياز الأنسجة الغنية

استكشف المزيد من الفيديوهات