تشريح والمناعية من تخيلي أقراص من ذبابة الفاكهة السوداء البطن

الهدف العام من هذا الإجراء هو تشريح الأقراص الخيالية من ذبابة الفاكهة اليرقات بالنسبة للكيمياء المناعية ، يتم تحقيق ذلك عن طريق إزالة مركب الرأس أولا الذي يتكون من الفم والخطافات والعين والأقراص الحلقية والدماغ من اليرقات. الخطوة الثانية هي إصلاح مركب الرأس واحتضانه بالأجسام المضادة الأولية والثانوية. بعد ذلك ، يتم فصل أقراص العين واللتين عن مجمع الرأس.

الخطوة الأخيرة هي تركيب الأقراص الخيالية في عامل مضاد للتبييض على شريحة زجاجية. في نهاية المطاف ، يمكن أن يكشف مراسلو الفلورسنت أو LAC Z وتلوين الأجسام المضادة عن التعبير المكاني والزماني للجينات والبروتينات داخل الأنسجة الخيالية باستخدام الفحص المجهري الفلوري. على الرغم من أنه يمكن استخدام هذه التقنية لتوفير نظرة ثاقبة لتوطين الجينات والبروتين في القرص الخيالي enten.

يمكن أيضا تطبيقه على الأنسجة الخيالية الأخرى ، مثل ساق الجناح ، والتوقف. هنا. لبدء التجربة ، املأ طبق بتري مقاس 35 ملم بمخزن مؤقت للتشريح. ضع 10 إلى 20 يرقة في طبق بتري واتركها تسبح لمدة خمس دقائق.

للتنظيف الذاتي باستخدام الآفة، تقوم الماصة بإنشاء مجموعة كبيرة من عازلة التشريح في منتصف لوحة التشريح القائمة على السيليكون. ضع ثلاثة أحواض أصغر تحيط بالمسبح الكبير واستخدم الملقط لنقل اليرقات إلى البركة السفلية. بعد ذلك ، باستخدام ملقط الرقم خمسة ، انقل يرقات واحدة نظيفة من البركة الصغيرة إلى التجمع الأكبر من المخزن المؤقت للتشريح.

لبدء التشريح الخشن ، استخدم زوجا واحدا من الملقط للاستيلاء على خطافات الفم والزوج الآخر من الملقط للاستيلاء على اليرقات برفق. عند ثلث طول جسمها ، يثبت خطاف الفم ثابتا. اسحب باقي الجسم بسرعة باستخدام زوج ثان من الملقط.

حرر اليرقة من الملقط واسمح للشجاعة بالانسكاب ، مما يمكن الأقراص الخيالية من البقاء في تأكيدها الطبيعي. ثم أمسك خطافات الفم واستخدم الزوج الآخر من الملقط لإزالة الثلثين السفليين من اليرقات ، بما في ذلك الأحشاء الداخلية. بعد ذلك ، قم بإزالة الغدد اللعابية وأقراص الساق والأنسجة الأخرى برفق.

الأنسجة الوحيدة التي يجب أن تبقى هي كمية صغيرة من البشرة العلوية. خطافات الفم ، وأقراص العين والتينال ، ونصفي الكرة المخية ، والعقدة البطنية. بعد 20 دقيقة كحد أقصى ، انقل جميع الأنسجة المقطوعة إلى الطفيلي الألدهيد ليسين المنبوذ.

مثبت التاريخ أو PLP. لا تسمح للأقراص الخيالية بالبقاء في مخزن التشريح لمدة تزيد عن 20 دقيقة ، وإلا ستتحلل بعد التشريح. انقل الأنسجة المقطوعة بزيادات قدرها 100 ميكرولتر إلى زجاج ساعة يحتوي على PLP بارد.

استخدم زوجا من الملقط للتأكد من أن الأنسجة المقطعة مغمورة تماما. احتضان الأنسجة المقطعة في مثبت PLP البارد لمدة 45 دقيقة في درجة حرارة الغرفة دون تحريض. بعد ذلك ، انقل 100 ميكرولتر من الأنسجة المقطوعة من PLP إلى المخزن المؤقت للغسيل.

تأكد من غمر الأنسجة بالكامل واحتضانها في درجة حرارة الغرفة دون تحريض لمدة 45 دقيقة. ثم انقل الأنسجة المقطوعة إلى أنبوب دقيق سعة 1.5 ملليلتر. قم بإزالة مخزن الغسيل واستبداله ب 100 ميكرولتر من محلول الحظر.

احتضن الأنسجة في درجة حرارة الغرفة مع دوران لطيف على دوار سطح الطاولة لمدة 10 دقائق. بعد الحظر ، قم بإزالة المحلول واستبدله ب 100 ميكرولتر من محلول الأجسام المضادة الأولية في مصل الماعز العادي بنسبة 10٪. احتضان الأنسجة في درجة حرارة الغرفة مع دوران لطيف لمدة 16 ساعة حسب قوة الجسم المضاد.

بعد ذلك ، قم بإزالة الجسم المضاد الأساسي واستبدله ب 750 ميكرولتر من محلول الغسيل. ضع الأنبوب على متحور في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق. قم بإزالة الأنبوب من المطفر واترك الرؤوس تستقر في قاع الأنبوب.

ثم قم بإزالة عازلة الغسيل وأضف 100 ميكرولتر من محلول الأجسام المضادة الثانوية في مصل عادي بنسبة 10٪. احتضان الأنبوب في درجة حرارة الغرفة مع دوران لطيف لمدة ساعتين على الأقل اعتمادا على قوة الجسم المضاد. بعد الحضانة ، قم بإزالة محلول الجسم المضاد الثانوي من الأنسجة.

استبدله ب 500 ميكرولتر من عازلة الغسيل واترك الأنسجة تستقر في قاع الأنبوب. ضع ثلاث برك من عازلة الغسيل على لوحة تشريح السيليكون. انقل جميع الأنسجة المقطوعة إلى مجموعة كبيرة من عازلة الغسيل التي تم وضعها على طبق التشريح.

يساعد ذلك على إزالة الأجسام المضادة الثانوية الزائدة لبدء التشريح الدقيق ، ووضع الجانب البطني المركب للرأس لأسفل وتثبيت البشرة من خطافات الفم. ضع زوجا ثانيا من الملقط في الفراغ بين أقراص الدماغ والعين واسحب الدماغ بسرعة بعيدا عن خطافات الفم لإزالة فصين في الدماغ مع الاستمرار في التمسك بخطافات الفم. اقرص الأنسجة في أقرب وقت ممكن من الاتصال بين قسم الهوائي في قرص هوائي العين وخطاف الفم.

استمر حتى يتم تشريح جميع الأنسجة المرغوبة. بعد ذلك ، أضف قطعتين صغيرتين من المناديل الورقية بحجم الغطاء ينزلق على بعد ثلاث بوصات على طبق التشريح. ضع شريحة زجاجية على هذه القطع من الورق لمنع الشريحة من الالتصاق بقاعدة السيليكون لطبق التشريح.

باستخدام رجال الماصة P 20 ، أضف تسعة ميكرولترات من العامل المضاد للتبييض إلى منتصف شريحة المجهر الزجاجي لمنع تبييض ضوء الفلورسنت للأنسجة بنفس الطرف غير المقطوع ، واجمع كل I والأقراص المؤقتة وأضفها إلى قطرة الكاشف المضاد للتبييض. بعد ذلك ، استخدم الملقط لفصل ونشر العين والأقراص الحلقية داخل قطرة الكاشف المضاد للتبييض حتى لا تتلامس الأقراص الخيالية. باستخدام فرشاة طلاء دقيقة ، قم بخفض زلة الغطاء برفق على قطرة عامل مضاد للتبييض لمنع تكوين فقاعات الهواء.

أخيرا ، قم بتخزين الشرائح عند سالب 20 درجة مئوية حتى تصبح جاهزة لعرض وتصوير أقراص الأيونات باستخدام الفحص المجهري الخفيف أو الفلوري. تنتج هذه الطريقة بشكل موثوق مواد عالية الجودة للتحليل كما تنقلها هذه الصور متحدة البؤر للأقراص الخيالية. تمت معالجة الأقراص بفلورو أربعة مترافق ومترافق ، والذي يرتبط بالأكتين وبالتالي يحدد كل خلية.

واحدة من أكثر السمات اللافتة للنظر في القرص الذهني هي الأخدود المورفوجيني ، والذي يمكن رؤيته على أنه مسافة بادئة داخل الأنسجة التي تمتد على طول المحور البطني الظهري. مع تقدم الأخدود عبر مجال العين ، يتحول بحر الخلايا المضطربة إلى مجموعة مرتبة من عيون الوحدة المتباعدة بشكل دوري أو Oma Tedia. يعد التحقق من التعبير النسيلي وتحليل القرص التخيلي I من التطبيقات النهائية الممكنة لهذه الطريقة.

تعرض اللوحات الثلاث العلوية أقراصا ملطخة بأجسام مضادة مختلفة مثل ILIS و A DPP و LAC Z النسخ المراسل وعلامات خاصة بالخلية مثل الرؤية الجنينية أو المميتة أو غير الطبيعية أو vy ، والتي تشفر بروتين ربط الحمض النووي الريبي العمومي. تظهر اللوحات الثلاث السفلية أقراصا يتم فيها استخدام GFP لتمييز مجموعات الخلايا. بمجرد إتقان الدورة ، سيستغرق عزل مجمعات الرأس من 10 إلى 20 يرقة حوالي 10 دقائق ، بالإضافة إلى ذلك ، سيستغرق العزل الدقيق للقرص الأيوني عن هذه المجمعات حوالي 10 دقائق أيضا.