3D تتبع المداري في التعديل المجهر ثنائي الفوتون: دراسة تطبيقية على تتبع من بين الخلايا الحويصلات

الهدف العام من هذا الإجراء هو توضيح كيفية تتبع العضيات سريعة الحركة مثل الجسيمات الحالة التي تتحرك في 3D داخل خلية حية. يتم تحقيق ذلك عن طريق تلطيخ الجسيمات الحالة والأنابيب الدقيقة أولا باستخدام أصباغ تجارية محددة داخل الخلايا الحية المستزرعة. الخطوة الثانية هي استخدام مجهر المسح بالليزر واستخدام طريقة التتبع المداري لمتابعة حركة الجسيمات الليزوزية بسرعة عالية ، ويتم اختيار حجم المدار والمعلمات الأخرى ، مثل استجابة التردد للنظام لإجراء تجارب التتبع.

في النهاية ، تظهر النتائج أنه من الممكن متابعة الجسيمات الحالة سريعة الحركة في ثلاثة أبعاد واكتشاف التفاعلات مع العضيات الأخرى الملطخة بالفلورسنت التي تمت مواجهتها على طول مدار الليزر أثناء التتبع. المزايا الرئيسية لطريقة التتبع ثلاثية الأبعاد على الطرق الأخرى الموجودة ، والتي تستند ، على سبيل المثال ، إلى Astigmats ، هي أن طريقة تتبع 3D من withal تسمح لنا بتتبع مجموعة كبيرة جدا من الخرف. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في طرح سؤال رئيسي في مجال النقل الحويصلي ، مثل كيفية تحرك الحويصلات على طول الأنابيب الدقيقة.

على الرغم من أنه يمكن استخدام هذه الطريقة لدراسة ديناميكيات الإندوسوم. يمكن استخدامه أيضا في أنظمة أخرى حيث يمكن تسمية الجسيمات المعزولة بالفلورسنت مثل مستقبلات غشاء الجسيمات النانوية أو مجمعات المنافذ النووية المجمعة أو المواقع الجينية التي يتم الحفاظ عليها من خلايا مبيض الهامستر الصينية أو خلايا CH K واحدة كما هو موضح في بروتوكول النص. بعد حصاد الخلايا ، ضعها على قطر 14 ملم.

بئر صغير بسمك سطح 0.16 ملم من خلايا البذور للحصول على الكثافة المثلى للتصوير حوالي 60 إلى 70٪ بطلاقة Co تحتضن الخلايا طوال الليل عند 37 درجة مئوية 5٪ CO2 في اليوم التالي ، اغسل الخلايا ثلاث مرات في محلول ملحي مخزن من Hank أو H-B-S-S-H-B-S-S يستخدم لإزالة الخلايا الميتة أو الحطام من لوحة الثقافة ولإعداد الخلايا لخطوة التلوين. ثم احتضان الخلايا في محلول HBSS يحتوي على تركيز نهائي من 50 متتبع ليو مولار و 150 مولر من متتبع التوبولين الأخضر لمدة ساعة واحدة عند 37 درجة مئوية بعد الحضانة. اغسل الخلايا ثلاث مرات في HBSS لإزالة أي صبغة غير مرتبطة.

أضف وسط نمو DMEM جديدا قبل تصوير الخلايا. يتم تجميع مجهر تتبع الجسيمات الموصوف في بروتوكول الفيديو على إطار مجهر مقلوب متاح تجاريا. يتم استخدام مصدر ضوء الإثارة بالليزر الحرباء المتماسكة الفائقة من التيتانيوم الياقوت فيمتو ثانية مع نطاق الطول الموجي الناتج القابل للضبط بين 690 نانومتر و 1040 نانومتر.

تأكد من محاذاة شعاع الليزر في المنفذ الخلفي للمجهر. باستخدام المرايا المطلية بالأشعة تحت الحمراء ، يتم تخفيف شعاع الليزر باستخدام صفيحة نصف موجة دوارة موضوعة أمام مستقطب الكالسيت ، مما يخفف من الشعاع بحيث يتراوح متوسط الطاقة في العينة بين 0.5 و مللي واط. اجمع ضوء التألق من العينة عن طريق وضع هدف مائي بفتحة عددية عالية في مسار الضوء.

بعد ذلك ، ضع العينة على مرحلة آلية واضبط الحركة الدقيقة لهدف المجهر. استخدام وحدة تحكم بيزو موضوعية. اختر مكعب مرشح مضان وفقا للأطوال الموجية للانبعاث المطلوب إما في تكوين قناة واحدة أو قناتين.

استخدم مرشحات تمرير نطاق البعث. لتحديد النطاق الطيفي للتألق المنبعث ، قم بتوجيه الضوء من مكعب المرشح إلى أنابيب مضاعف الصور حيث يتم تضخيم الإشارة وتمييزها وإرسالها إلى بطاقة الحصول على بيانات إخراج الإدخال الرقمي لتصوير الخلايا ووضعها على المسرح والتركيز باستخدام إضاءة الضوء المرسلة. قم بالتبديل إلى التصوير بالمسح النقطي لتحديد الخلايا التي أدرجت الصبغة ، ولتصور الأنابيب الدقيقة الأساسية ، وتحديد المنطقة الأولية التي توجد فيها حركة الحويصلة.

بمجرد تحديد حويصلة معزولة ، قم بتعيين معلمات التتبع المداري. أولا ، حدد نصف قطر المدار لتحديد حجم المسح الدائري وفقا لحجم الجسيم الذي يتم تتبعه. بالنسبة لباعث النقطة ، اضبط نصف قطر المدار مساويا لخصر وظيفة انتشار النقطة أو PSF لحزمة الإثارة.

لتعظيم الحساسية والاستجابة. اضبط المسافة المحورية لتحديد المسافة بين المدارين اللذين يتم إجراؤهما لتوطين موضع الجسيمات على طول الاتجاه المحوري. اضبط المسافة المحورية على 1.5 إلى ثلاثة أضعاف نفايات PSF.

حدد وقت السكون وفقا لسطوع الجسيم ، لضبط الوقت المستغرق في كل نقطة من المدار ، والذي سيحدد أيضا معدل تبييض الصورة. استخدم وقت مكوث يتراوح بين 10 و 100 ميكروثانية. اضبط عدد النقاط في كل مدار على 64 أو 128 لإنتاج فترات مدار في حدود أربعة إلى 32 مللي ثانية ، وتوفير دقة زمنية عالية لتحديد موضع الجسيمات.

قم بتغيير إشارة إزاحة التيار المستمر المرسلة إلى المرايا من أجل توسيط الحزمة على الجسيم من خلال واجهة المستخدم الرسومية عبر تحديد المؤشر في الصورة النقطية الممسوحة ضوئيا. ابدأ التتبع عن طريق تبديل وضع المجهر من التصوير النقطي إلى المسح المداري. تنشيط التغذية الراجعة وجمع البيانات لتحليل المسار.

استخدم البرنامج لعرض التألق الذي تم جمعه في كل نقطة على طول المدار وفي كل نقطة زمنية على شكل سجادة شدة. توفر الكثافة التي تم جمعها على طول السجادة معلومات عن تفاعل الجسيم مع الأجسام الساطعة الأخرى. اعرض كل من معلومات المسار بالإضافة إلى شدة التألق التي تم جمعها من أنبوب مضاعف الصور بمرور الوقت في شكل سلاسل زمنية.

استخدم تمثيل السلاسل الزمنية ومعلومات سجادة الكثافة لتحديد منطقة الاهتمام في المسار فقط. ثم اعرض إسقاطا ثنائي الأبعاد للجزء المحدد من مسار الجسيمات. حدد عناصر التحكم المناسبة لترميز المسار اللوني وفقا لشدة مضان الجسيمات.

حدد الخيار لعرض مسار الجسيمات في 3D وترميز اللون وفقا لشدة التألق. قم بتدوير المسار في 3D باستخدام عناصر التحكم لتصور ميزات حركة الجسيم الليزومي على طول الأنابيب الدقيقة. باستخدام تلطيخ صبغة خضراء فلورية للجسيمات الحالة والأنابيب الدقيقة ، من الممكن تصوير الحركة عالية السرعة للحويصلات على طول الأنابيب الدقيقة باستخدام مجهر المسح الضوئي بالليزر ثنائي الفوتون.

ومع ذلك ، فإن التصوير بالمسح النقطي لا يحتوي على الدقة الزمنية اللازمة لمتابعة حركة الجسيمات الداخلية الأسرع بدقة إذا تم استخدام التتبع المداري. بدلا من ذلك ، تظهر البيانات أنه من الممكن الحصول على مسارات إزاحة x و y و Z بدقة زمنية تبلغ 32 مللي ثانية. في هذه الإزاحة مقابل مسارات الوقت ، يعرض تحليل السجاد الشدة المسجلة على طول كل مدار.

بمرور الوقت ، يوفر مسار الشدة معلومات عن محيط الفلورسنت للجسيم. تتوافق المنطقة المعلبة مع جزء المسار بين قفزتين. تتوافق النقاط المضيئة خارج المنطقة المعلبة مع تفاعلات الجسيم مع الأجسام الساطعة الأخرى وترتبط بالقفزات في المسار حيث تتركز المدارات على ألمع مصدر الفلورسنت.

أثناء التتبع ، يمكن تسجيل الكثافة المتكاملة للتألق المنبعث. يعرض المسار ثلاثي الأبعاد المعاد بناؤه حركة موجهة كما هو متوقع من حويصلة تتحرك على شبكة الأنابيب الدقيقة. بالإضافة إلى ذلك ، من الممكن ربط المسار ثلاثي الأبعاد ب RAs أو مسح صورة المنطقة المحيطة.

هذا يؤكد حركة الجسيم على طول اتجاه حزمة الأنابيب الدقيقة. بمجرد إتقانها ، يمكن القيام بهذه التقنية في غضون ساعات قليلة إذا تم أداؤها بشكل صحيح أثناء المحاولة. من المهم أن تتذكر هذا الإجراء استخدام مستوى طاقة الليزر غير الضار بعينتك أثناء استخدامه للاقتباس الضوئي كما هو موضح في هذا البروتوكول ، يجب الحفاظ على مستويات الطاقة حوالي مللي فولت بعد الأهداف.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد جدا لكيفية إعداد تجربة باستخدام طريقة التتبع المداري ثلاثية الأبعاد ، والتي تسمح بتتبع الأجسام ذات النطاق Z الكبير جدا.