إنتاج وعزل محاور عصبية من الخلايا العصبية الحسية لتحليل الكيمياء الحيوية باستخدام مرشحات المسامية

تصف هذه المقالة نظام زراعة الخلايا العصبية الذي يمكن استخدامه للحصول على كميات كبيرة من العينات المحورية النقية للتحليلات الكيميائية الحيوية والكيميائية المناعية. ستسمح هذه التقنية بفهم أفضل لفسيولوجيا المحور الطبيعي ومسارات الإشارات التي تؤدي إلى التنكس العصبي.

الهدف من هذا الإجراء هو الحصول على مستحضرات محورية نقية مناسبة للفحص بواسطة التقنيات الكيميائية التقليدية أو الكيميائية الحيوية أو المناعية. يتم تحقيق ذلك عن طريق زراعة الخلايا العقدية الجذرية الظهرية الجنينية أولا على إدخالات الثقافة التي تحمل مرشحا غشائيا مساميا حيث تقوم الخلايا العصبية DRG بتمديد المحاور. تنمو بعض المحاور من خلال المسام الموجودة في المرشح وتمتد على سطحها السفلي بينما تظل أجسام الخلايا معزولة على السطح العلوي بعد التلاعب التجريبي المطلوب ، يتم الحصول على المستحضر المحوري عن طريق إزالة الخلايا الموجودة على الجانب العلوي من المرشحات مع الحفاظ على المحاور التي نمت على الجانب السفلي.

في النهاية ، يمكن وضع المحاور المعزولة للتحليلات الكيميائية الحيوية أو تثبيتها للفحص الكيميائي المناعي عن طريق إنتاج عينات محورية نقية مناسبة للتحليل بواسطة التقنيات الكيميائية الحيوية التقليدية. أثبت هذا الإجراء أنه مفيد جدا للتحقيق في فسيولوجيا الفيزيولوجيا المرضية للمحاور العصيبية. كما سترى ، فإن هذه التقنية سهلة التنفيذ نسبيا ويمكن تكييفها مع إعدادات تجريبية معينة.

سنوضح استخدامه في دراسة آليات التنكس المحوري في اليوم السابق للطلاء. ابدأ بطلاء المرشحات تحت غطاء مزرعة الأنسجة المعقم. المركز الأول ، يتم إدراج مرشح 24 ملم في لوحة استقبال بستة آبار.

ثم أضف ملليلترين من مليغرام واحد لكل مليلتر ، بولي دي ليسين في الماء إلى المقصورة السفلية ومليلتر واحد إلى الأعلى ، واحتضان الإدخالات لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. لها بعد ذلك ، استنشق بولي دي ليسين ، مع التأكد من إزالة بقايا السائل الذي يصبح محاصرا مباشرة تحت الفلتر. ثم اشطفها مرة واحدة بالماء بعد شفط الماء ، وأغلق الغطاء واترك الألواح لتجف في الغطاء طوال الليل.

في صباح اليوم التالي ، اخلطي وسخني محلول مائي وصفح على حرارة 37 درجة مئوية. احتضان الحضانات في محلول اللامينين لمدة ساعة واحدة في حاضنة خلية عند 37 درجة مئوية باستخدام الأحجام القياسية. بعد الشفط.

يضيف اللامينين 0.1 ملليغرام لكل مليلتر ، والكولاجين في الماء ويحتضن لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة ، ثم يشمح الكولاجين ويغسل مرة واحدة بالماء المعقم. أصبحت المرشحات جاهزة الآن لتلقي وسائط الثقافة و DRG explan بعد تشريح وقطع رأس جنين فأر E 13 كما هو موضح في بروتوكول النص. ضع الجنين على جانبه في طبق بتري مملوء بوسائط L 15 أثناء المراقبة من خلال مجهر تشريح ، وقم بعمل شق على طول الجوانب الجانبية للتخلص من الصدر وأطراف البطن والذيل.

ضع الجزء الخلفي الذي يحتوي على الجانب البطني للعمود الفقري لأعلى وقم بإزالة جميع الأعضاء الحشوية باستخدام مقص زنبركي صغير. كشف الحبل الشوكي بالكامل عن طريق قطع العمود الفقري من جانبه البطني على طول خط الوسط. أمسك الذبيحة لأسفل بزوج واحد من الملقط رقم ثلاثة واستخدم زوجا ثانيا لتثبيت الحبل الشوكي من خلال جوانبه المنقارية.

الآن ، اسحب الحبل ببطء وبلطف بعيدا عن التجويف الفقري. عندما تتعرض DRGs ، استخدم ملقطا رقيقا للغاية رقم خمسة لقرصها من الحبل الشوكي. ضع DRGs المنفصلة في قاع الطبق باستخدام طرف ماصة سعة 200 ميكرولتر تم تقطيعه للتكبير.

افتتاحه. استنشق DRGs المجمعة وضعها في أنبوب على الجليد. استكمل وسائط المقصورة السفلية مع 15 نانوغرام لكل ملليلتر من NGF مع الحفاظ على المقصورة العلوية خالية من NGF.

بعد ذلك ، أضف وسائط DRG كاملة عند 37 درجة مئوية إلى الإدخالات المطلية باستخدام وحدات التخزين القياسية. ثم استخدم ماصة سعة 1000 ميكرولتر مع حافة طرف لتكبير فتحتها. اضبط الماصة على 800 ميكرولتر.

ثم انقل ما يقرب من 200 ميكرولتر من الوسائط من الجانب العلوي من المرشح إلى DRG التي تحتوي على ماصة أنبوبية بحجم صغير لأعلى ولأسفل من أجل تعليق إعادة تشغيل D RRGs التي غرقت في الأسفل. بمجرد إعادة تعليق شفط الحجم بالكامل، انقل DRGs الآن إلى المرشح عن طريق غمر طرف الماصة في منتصف الملحق وطرد DRGs. حافظ على المزارع في حاضنة الخلايا عند 37 درجة مئوية.

تغيير الوسائط كل يومين إلى ثلاثة أيام لتغيير الوسائط. استنشق المقصورة العلوية أولا ، متبوعا بالمقصورة السفلية. أضف وسائط جديدة بأحجام قياسية بدءا من المقصورة السفلية لدراسة تأثير سحب العامل الغذائي على المحاور.

انتظر يومين للسماح بالتمدد المحوري. بعد ذلك ، قم بإزالة الوسائط من المقصورات العلوية والسفلية. ثم لعزل أي متبقي أو منتج داخليا و GF إضافة وسائط تفتقر إلى NGF وتحتوي على أجسام مضادة مضادة ل NGF.

أعد الألواح إلى حاضنة الخلية عند 37 درجة مئوية للسماح للتنكس الناجم عن انسحاب NGF بالمضي قدما في القدر المطلوب من الوقت للدراسة أثناء التنكس الآريوسي. استخدم عوامل التصفية التي تحتوي على DRG explan المحفوظة في NGF لمدة يومين. استخدم مكشطة خلوية لكشط DRGs من الجانب العلوي من المرشح.

تأكد من الإزالة الكاملة لأجسام الخلايا العصبية عن طريق تحريك الكاشطة ذهابا وإيابا في اتجاهين x و y وفي دوائر. تأكد من نجاح الكشط عن طريق التحقق من عدم بقاء نباتات X متصلة بالفلتر. بعد ذلك ، تخلص من الوسائط التي تحتوي على النباتات العائمة من المقصورة العلوية وأضف ملليلترا واحدا من وسائط DRG الكاملة الدافئة مسبقا التي تحتوي على 10 نانوجرام لكل مليلتر و gf.

ثم أعد اللوحة إلى حاضنة الخلية عند 37 درجة مئوية للسماح لتنكس الحائط بالمضي قدما لمقدار الوقت المطلوب لاستخراج البروتين من العينات المحورية. ابدأ بملء أنابيب تجميع 1.5 مل ب 75 ميكرولتر من عينة أوراق الضأن المؤقتة وضع الأنابيب على الثلج. اغسل الفلتر الذي يحتوي على DRG explan في PBS وكشط الجانب العلوي من الفلتر كما كان من قبل.

بعد إزالة الحشوة من اللوحة ، استخدم قضيب بطرف قطني لتنظيف الجانب العلوي من الفلتر. ثم استنشق أي PBS إضافي من الجانبين العلوي والسفلي. بعد ذلك ، ضع الملحق رأسا على عقب على مقعد واستخدم مشرطا حادا لقطع الفلتر من الملحق.

ثم أمسك الفلتر بالملقط. من الأسفل إلى الأعلى. استخدم المقص لعمل قطع من المحيط إلى مركز الفلتر.

الآن ضع الفلتر أعلى أنبوب التجميع وبملقط ، اضغط على مركز الفلتر أسفل الأنبوب. أثناء القيام بذلك ، سيتشكل قمع يدفع المرشح على شكل قمع إلى أسفل الأنبوب بحيث يتم غمره في المخزن المؤقت لعينة اللالي. أكمل الآن استخراج البروتين عن طريق تغطية الأنابيب ووضعها في الماء المغلي لمدة أربع دقائق.

قم بإزالة الفلتر باستخدام ملقط وضعه رأسا على عقب في الجزء العلوي من الأنبوب وقم بطرده لفترة وجيزة. عند الانتهاء ، تخلص من المرشحات المجففة للتألق المناعي. اغسل الإدخالات في PBS في ستة ألواح بئر.

ثم قم بإصلاح الإدخالات في الألدهيد الطلائلي المحضر حديثا بنسبة 4٪ في PBS لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة على شاكر بعد التثبيت ، وكشط وتنظيف الجانب العلوي من الإدخالات للتأكد من أن المحاور التي نمت حصريا على السطح السفلي للمرشح فقط هي التي سيتم تلطيخها. ثم قم بإجراء التألق المناعي القياسي كما هو موضح في بروتوكول النص. بمجرد اكتمال جميع حضانات التألق المناعي.

اسكب PBS من آخر غسلة. نظف الجانب العلوي من الفلتر باستخدام قضيب بطرف قطني واستنشق أي سائل متبقي من الجانبين العلوي والسفلي. ضع الملحق رأسا على عقب على المقعد واستخدم مشرطا حادا لقطع الفلتر من الملحق.

ثم أمسك الفلتر بالملقط لأعلى. ضعه على شريحة مجهرية. استخدم وسائط التثبيت المتوافقة مع الفلورسنت لوضع غطاء ينزلق فوق الفلتر واترك الفلتر يجف بشكل مسطح في الظلام عند أربع درجات مئوية.

تم الانتهاء من فحص الصور والتقاطها باستخدام مجهر الفلورسنت. ينتج عن الطلاء المتسلسل للمرشحات التي تحتوي على البولي ليسين واللامينين والكولاجين نباتات تنمو محاور أكثر وأطول مقارنة بتلك التي تزرع بالبولي ليسين وحده أو البولي يسين والكولاجين تحت نفس الركيزة. ظروف الطلاء.

تظهر DRG Explan التي تم الحفاظ عليها على المرشحات نموا محوريا أكثر غزارة بكثير من نباتات X المزروعة على البلاستيك. المستحضر المحوري الذي تم الحصول عليه بعد كشط الجانب العلوي من المرشح خال من نوى الخلية مما يدل على استبعاد أجسام الخلايا من الجانب السفلي من المرشح الموضح. فيما يلي أمثلة على المحاور التي نشأت من حوالي 17 مخططا ، والتي امتدت عبر مسام المرشح لتنمو على الجانب السفلي من مرشح 24 ملم.

تظهر البقع المناعية من المحللات التي تم جمعها من قمم المرشح مقابل القيعان أن هيستون H three علامة نووية تقتصر على قمم المرشح. تم تطبيع محتوى البروتين الكلي عبر العينات المختلفة. يتم عرض تجارب الحرمان من NGF في هذه الصور بتكبيرات مختلفة من المستحضرات المحورية من explan المحفوظة في NGF أو المحرومة من NGF لمدة 12 أو 36 ساعة.

دراسات التنكس المحوري الآري للجدار في هذه الصور للمستحضرات المحورية من النباتات الخارجية السليمة أو بعد ثلاث إلى 7.5 ساعات من القطع ، كما هو الحال في النماذج الأخرى للتنكس الحائقي. خمسة مللي مولار NAD plus يحمي من التنكس الناجم عن القطع بمجرد إتقانه. هذه التقنية قوية وسهلة التكاثر.

يسمح بتوليد كميات كبيرة من المستحضرات المحورية الموثوقة منذ أن وصفها تويست وزملاؤه لأول مرة في عام 2001. تم استخدام أشكال مختلفة من هذه التقنية لاستكشاف العديد من جوانب فسيولوجيا المحاور والتغصنات. راجع الاقتباسات في بروتوكول النص لاكتشاف التطبيقات الأخرى لهذه التقنية.