وبيوشيب الكهروكيميائية استنادا ميكروفلويديك لتسمية خالية تحليل الحمض النووي التهجين

الهدف العام من التجربة التالية هو مراقبة تأثير أحداث تهجين الحمض النووي على أطياف المعاوقة باستخدام جهاز كهروكيميائي ميكروفيليدي. للقيام بذلك ، يتم تصنيع شريحة كهروكيميائية لتمكين مجموعة من مستشعرات الأقطاب الكهربائية ويتم تصنيع شريحة PDMS ميكروفلويديك. لتسهيل إدخال عينات الحجم الصغير ، يتم ربط الشريحتين معا وتشغيلهما باستخدام مجسات الحمض النووي المفردة التي تقطعت بها السبل.

ثم يتم إضافة الحمض النووي المستهدف أحادي الشريطة عند تهجين الحمض النووي ، وتؤدي قوة التنافر الأقوى بين الحمض النووي المزدوج سالب الشحنة وجزيئات السيانيد فيريس السيانيد سالبة الشحنة إلى مقاومة أعلى لنقل الشحنة. في النهاية ، يمكن اكتشاف أحداث تهجين الحمض النووي عن طريق قياس التغيرات في أطياف المعاوقة الكهروكيميائية. الميزة الرئيسية لهذه التقنية على الطرق الحالية ، مثل استخدام قارئ اللوحة أو اختبار التحول J ، هي أن الأجهزة يمكنها أداء نفس التقنية بحجم عينة منخفض وبجزء بسيط من التكلفة دون التضحية بالحساسية أو الخصوصية.

يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في أبحاث السرطان واكتشاف الأنفلونزا والهندسة الوراثية من خلال تمكين الفحص السريع لتسلسل الحمض النووي المحدد والتحقيق في الحركية الثنائية لتسلسلات الحمض النووي المفردة التي تقطعت بهم السبل. نظرا لأن طريقة تحليل تهجين الحمض النووي السريعة عالية الإنتاجية يمكن أن تعمل بحجم عينة منخفض وبدون خطوات معقدة لتحضير العينة ، فإن الآثار المترتبة على هذه التقنية تمتد إلى تشخيصنا للاضطرابات الوراثية أو أشكال مختلفة من السرطان أو الأمراض ذات علامات الحمض النووي المحددة مثل الأنفلونزا. بشكل عام ، سيكافح الأفراد الجدد في هذه الطريقة لأن تطوير الأجهزة الصغيرة يتطلب معلمات معالجة تحكم ونهج تكراري لحل المشكلات مثل تسرب الحلول.

بعد تجميع الجهاز لنقش أقطاب كهربائية ذهبية على الشريحة الكهروكيميائية ، أمسك رقاقة سيليكون فارغة من الدرجة أربعة بوصات مع ملاقط واستخدم زجاجة غسيل لشطف سطح جانبي الرقاقة بالأسيتون والميثانول ثم الأيزوبروبانول. يشار إلى هذه العملية فيما يلي باسم تنظيف A MI تحت تيار من الماء منزوع الأيونات. اشطف الأيزوبروبانول من الرقاقة ، ثم استخدم مسدس النيتروجين لتجفيف الرقاقة.

قم بتحميل الرقاقة في ترسيب بخار كيميائي محسن بالبلازما أو معدات P-E-C-V-D. أدخل المعلمات لإنتاج طبقة ثاني أكسيد السيليكون بسمك ميكرومتر واحد وابدأ العملية الآلية بعد ذلك ، باستخدام أداة الاخرق DC ، قم بإيداع طبقة من الكروم بسمك 200 أنجستروم على الرقاقة ، ثم قم بإيداع طبقة من الذهب بسمك 2000 ستروم. قم بتحميل الرقاقة على الدوار ، وقم بغبار السطح بمسدس نيتروجين وباستخدام ماصة المعجنة ، قم بتطبيق تدور PR لمقاومة الصورة الإيجابية لإنشاء فيلم موحد يبلغ سمكه حوالي 1.6 ميكرومتر.

ثم اخبز الرقاقة مسبقا لمدة دقيقة واحدة عند 100 درجة مئوية على طبق ساخن. قم بتحميل الرقاقة بمقاومة الصور في معدات تقويم القناع. ثم ابدأ تعريضا ضوئيا بمقدار 190 مللي جول لكل سنتيمتر مربع عند 405 نانومتر حيث سيفتح محاذاة القناع الغالق ويعرض الصورة المقاومة للضوء من خلال قناع بالميزات المصممة.

بعد التعرض ، اغمر الرقاقة في طبق زجاجي يحتوي على 3 5 2 مطور واحتضانها لمدة 30 ثانية مع رج لطيف. ثم اشطف الرقاقة تحت تيار من الماء وجففها بمسدس النيتروجين كما كان من قبل. بعد ذلك ، اغمر الرقاقة في طبق زجاجي يحتوي على محلول نقش الذهب واحتضانها لمدة 1.5 دقيقة مع رج لطيف.

ثم انقل الرقاقة إلى طبق زجاجي يحتوي على الكروم المذكور واحتضانها مع رج لطيف حتى تختفي علامات الكروم على الرقاقة. يجب أن يستغرق هذا حوالي 30 ثانية. اشطف الرقاقة بالماء وجففها بمسدس النيتروجين الذي يمسك الرقاقة بالملاقط.

قم بتجريد مقاومة الصورة باستخدام إجراء تنظيف MI. ثم اشطفها بماء DI وجففها بمسدس النيتروجين مرتديا طبقتين من القفازات. اغمر الرقاقة في طبق تفلون بمحلول سمكة البيرانا النظيف لمدة دقيقة واحدة.

ثم شطف الرقاقة بالماء دي وجففها بمسدس النيتروجين. بجانب نمط الأقطاب الكهربائية البلاتينية ، قم بتحميل الرقاقة على دوار. قم بغبار السطح باستخدام مسدس نيتروجين وباستخدام ماصة لصق ، قم بتوزيع PR اثنين من مقاومة الصور الإيجابية على دوران السطح لإنشاء فيلم موحد يبلغ سمكه حوالي 1.4 ميكرومتر.

ضعي الرقاقة على طبق ساخن على حرارة 100 درجة مئوية واخبزيها مسبقا لمدة دقيقة واحدة. بعد الخبز المسبق ، قم بتعريض الرقاقة عند 30 مللي جول لكل سنتيمتر مربع 405 نانومتر من خلال قناع صور. ثم ضعي الرقاقة على طبق ساخن على حرارة 125 درجة مئوية واخبزيها لمدة 45 ثانية.

قم بإزالة القناع من القناع والتقويم والفيضان. قم بتعريض الرقاقة بطول موجي 405 نانومتر بدون قناع صوري. بعد التعرض ، قم بتطوير الرقاقة عن طريق غمرها في طبق زجاجي يحتوي على ستة إلى واحد من حل مطور Z 400 K.

احتضن لمدة دقيقتين مع رج لطيف. ثم شطف الرقاقة بالماء دي وجففها بمسدس النيتروجين. باستخدام نظام تبخر الشعاع الإلكتروني ، قم بإيداع طبقة سميكة من التيتانيوم 400 أنجستروم متبوعة بطبقة بسمك 1600 أنجستروم من البلاتين على الرقاقة.

ضع الرقاقة في طبق زجاجي مملوء بالأسيتون وضع الطبق في حمام بالموجات فوق الصوتية لمدة خمس دقائق لرفع الصورة. قاوم ثم أمسك الرقاقة بالملاقط. استخدم زجاجة غسيل لشطف سطحي الرقاقة بالأسيتون ثم الأيزوبروبانول.

اشطف الرقاقة بالماء وجففها بمسدس النيتروجين. لتحضير القالب لقنوات الفحص ، اشطف رقاقة سيليكون فارغة بجودة اختبار بأربع بوصات باستخدام إجراء MI clean. كما كان من قبل ، اشطف الأيزوبروبانول من الرقاقة بالماء ، متبوعا بالتجفيف بمسدس نيتروجين.

قم بتحميل الرقاقة على الدوار ، ونفض الغبار عن سطح الرقاقة بمسدس نيتروجين وباستخدام ماصة الباستي ، قم بتوزيع PR على ثلاث صور سلبية مقاومة على السطح لإنشاء فيلم موحد يبلغ سمكه حوالي 100 ميكرومتر. ضع الرقاقة على طبق ساخن لخبزها مسبقا باستخدام عملية خبز من خطوتين. أولا ، قم برفع درجة الحرارة من درجة حرارة الغرفة إلى 65 درجة مئوية عند 300 درجة مئوية في الساعة.

ثم استمر في 65 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. منحدر يصل إلى 95 درجة مئوية عند 300 درجة مئوية في الساعة ثم استمر لمدة 30 دقيقة. كشف الرقاقة بطول موجي 2 ، 500 مللي جول لكل سنتيمتر مربع عند 405 نانومتر من خلال قناع الصورة.

ثم ضع الرقاقة على طبق ساخن واخبز الرقاقة بعد ذلك عن طريق تكثيف درجة حرارة الغرفة إلى 95 درجة مئوية عند 300 درجة مئوية في الساعة. استمر في 95 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. اغمر الرقاقة في طبق زجاجي يحتوي على البروبيلين جلايكول أو أسيتات الأثير أحادي ميثيل أو مطور P-G-M-E-A واتركها تتطور لمدة 10 دقائق.

اشطف الرقاقة بالأيزوبروبانول وجففها بمسدس نيتروجين لتصنيع قنوات الفحص للعثور على حاوية حول رقاقة القالب بورق الألمنيوم وصب ببطء بولي ثنائي ميثيل سوبوكسان أو PDMS غير المعالج فوق القالب. اخبز القالب باستخدام PDMS في فرن صندوقي باستخدام إجراء خبز من خطوتين حيث ترتفع درجة الحرارة من درجة حرارة الغرفة إلى 80 درجة مئوية على مدى خمس دقائق وتبقى عند 80 درجة مئوية لمدة 17 دقيقة. بعد أن يبرد القالب ، انزع PDMS من القالب وضعه على ورق الألمنيوم.

قم بقص رقائق الفحص بسكين جراحي وحدد الثقوب باستخدام أداة تثقيب الخزعة كما هو موضح هنا. قم بمحاذاة قنوات فحص PDMS يدويا مع الأقطاب الكهربائية العاملة على الشريحة الكهروكيميائية. يلتصق PDMS جيدا بالشريحة الكهروكيميائية ، ويغلق القنوات ويمنع التسرب.

قم بتوصيل الأنابيب المرنة بكوع بلاستيكي أو موصل مستقيم باستخدام أنبوب مرن قصير كمحول لتشغيل القنوات الصغيرة العمودية. قم بتوصيل حقنة تحتوي على مسبار الحمض النووي الفردي الذي تقطعت به السبل بالأنبوب وضعه في مضخة حقنة. قم بتوصيل الموصلات بكل من المداخل المثقوبة بالكامل في الجهاز.

أصعب جانب في هذا الإجراء هو تدفق المحلول في القنوات الدقيقة دون توليد فقاعات. لضمان النجاح ، قم بتدفق المحلول ببطء شديد لتحقيق ملء متجانس للقناة ، ابدأ المضخة بمعدل تدفق يبلغ 200 ميكرولتر في الساعة لملء كل قناة من القنوات الدقيقة الثلاث المنفصلة ببطء بمحلول حضانة مسبار DNA واحد تقطعت به السبل. بعد الحضانة لمدة ساعة واحدة ، قم بتبديل أنبوب المحقنة والموصل لشطف القنوات الدقيقة باستخدام PBS بعد ذلك ، قم بتبادل أنابيب الحقنة والموصلات لملء القناة الدقيقة بمحلول يتكون من واحد مليمولار ستة مير CAPTO واحد H من الإيثانول MCH في 10 مللي مولار PBS 100 مللي مولار كلوريد الصوديوم ، و 1.395 ملليمولار TCEP حاضنة لمدة ساعة واحدة.

ثم اشطفها باستخدام PBS كما كان من قبل باستخدام الملقط. ارفع PDMS الذي تم تدويره بزاوية 90 درجة إلى الاتجاه الأفقي ووضعه لأسفل. سيؤدي ذلك إلى كشف صفوف منفصلة من غرف التفاعل حيث يحتوي كل صف على عداد فريد وقطب كهربائي مرجعي لتحليل تهجين الحمض النووي.

تبادل ، أنابيب المحقنة والموصلات لملء القنوات الصغيرة بحل قياس التحكم في سترات الصوديوم الملحية المركزة SSC تحتضن لمدة 20 دقيقة بعد الحضانة تبادل المحقنة لملء القنوات الصغيرة بخمسة مللي مولار فيريس سيانيد خمسة مللي مولار سيانيد فرعون في محلول PBS. ثم لتسجيل قيم مقاومة الخلفية للنظام الكهروكيميائي لترددات مختلفة عن طريق التحليل الطيفي للمقاومة الكهروكيميائية أو EIS ، قم بتوصيل إحصائيات محتملة بعداد العمل والأقطاب الكهربائية المرجعية باستخدام أطراف المسبار. أدخل معلمات قياس EIS في برنامج الكمبيوتر ثم ابدأ القياس.

كرر هذا القياس لكل قطب كهربائي يعمل في القنوات الدقيقة لقياس تهجين الحمض النووي لكل تبادل هدف للحمض النووي غير التكميلي والتكميلي. أنبوب المحقنة والموصل. املأ القنوات الدقيقة بمخزن SSC مركز أربعة × يحتوي على ميكرومولار واحد من الحمض النووي المفرد المستهدف الذي تقطعت به السبل واحتضانه لمدة 20 دقيقة.

قم بإجراء القياسات عن طريق بدء قياس EIS باستخدام برنامج على الكمبيوتر لكل حل DNA واحد تقطعت به السبل للتحقق من صحة النشاط الكهروكيميائي للرقاقة الحيوية المجلد الدوري. تم أخذ قياسات القياس عن بعد في القنوات الدقيقة المملوءة بأكسدة الاختزال الكهربائية. يظهر الشكل المتشابه وارتفاعات الذروة وفصل الذروة لجميع الأقطاب الكهربائية قابلية عالية للاستنساخ لإثبات قدرة الرقائق الحيوية على اكتشاف أحداث تهجين الحمض النووي.

تم قياس الاختلافات في المعاوقة الكهروكيميائية لأحداث التهجين بين ثلاثة مجسات DNA أحادية الشريطة وأهداف الحمض النووي المفردة التي تقطعت بهم السبل وأهدافها المفردة المجانية وغير المكملة ، لوحظت تغيرات أعلى في مقاومة نقل الشحنة عند إدخال هدف الحمض النووي أحادي الشريطة التكميلي وهجينه مع المسبار مقارنة بإدخال أهداف الحمض النووي أحادية الشريطة غير المكملة لإثبات حساسية المستشعر الحيوي. تم إدخال تركيزات مختلفة من هدف الحمض النووي أحادي الشريطة التكميلي إلى مسبار الاستشعار الموضح هنا عبارة عن مخطط nyquist لقياسات التحليل الطيفي للمقاومة الكهروكيميائية بعد إدخال زيادة تركيزات الحمض النووي المفردة التي تقطعت بها السبل المشار إليها بالسهم الموجود على الرسم البياني. شوهدت قيم مقاومة متزايدة عند ترددات منخفضة حوالي 15 هرتز لتركيزات الحمض النووي المستهدفة المفردة التي تقطعت بها السبل بسبب قوى التنافر الأقوى بين الحمض النووي المزدوج الذي تقطعت به السبل وجزيئات سيانيد فيريس سيانيد فيرو.

بشكل عام ، تظهر BIOCHIPS القدرة على الإحساس بسرعة بوجود أحداث تهجين الحمض النووي. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تطوير وتصنيع جهاز كهروكيميائي ميكروفيليدي واستخدامه للكشف عن أحداث تهجين الحمض النووي. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر تحسين معلمات السير المختلفة مثل نسبة الإشارة إلى الممرضة والاستقرار والحساسية بعد هذا الإجراء.

يمكن إجراء طرق أخرى مثل إدخال أهداف الحمض النووي المفردة التي تقطعت بهم السبل مع تسلسلات مختلفة قليلا من الأحماض النووية من أجل الإجابة على أسئلة إضافية مثل تركيبة طفرة الحمض النووي والمنافسة. لا تنس أن العمل مع حلول عملية التصنيع الدقيقة يمكن أن يكون خطيرا للغاية ، ويجب أن تحذر حماية الجسم والعين واليد دائما أثناء تنفيذ هذا الإجراء.