في فيفو حقن مكروي و Electroporation ماوس الخصية

توضح هذه المقالة حقن مكروي و electroporation الماوس الخصية في الجسم الحي كأسلوب ترنسفكأيشن لخلايا الخصية الماوس لدراسة عمليات فريدة من الحيوانات المنوية. يتضمن بروتوكول المعروضة خطوات إعداد الزجاج الشعرية، حقن مكروي عبر القناة ناقل، وترنسفكأيشن بواسطة Electroporation لل.

الهدف من هذا الإجراء هو إجراء الحقن المجهري للتركيبات الجينية في خصية الفأر ، متبوعا ب InVivo الكهربائي. هذا يسمح بإجراء تحليل جيني شامل مع التركيز على تكوين المنوية ووظيفة الخصية. يتم تحقيق ذلك عن طريق الوصول إلى الخصية أولا عن طريق شق في البطن مباشرة فوق غدد PrepU.

الخطوة الثانية هي تحضير الخصية المرفقة بالقناة الصادرة للحقن المجهري عن طريق تحرير الوعاء من أنسجته الدهنية. بعد ذلك ، يتم ثقب قناة الأنف والأذن والحنجرة بماصة حقن مجهرية محملة ، ويتم إعطاء محلول البناء الجيني للبقع للأنابيب الحديدية في الخصية. الخطوة الأخيرة هي تعداء التثقيب الكهربائي متعدد الأطراف للخصية.

في النهاية ، يتم استخراج الخصية المنقولة بعد ثلاثة أيام من أجل تقييم التعدي عن طريق الفحص المجهري الفلوري أو عن طريق قياسات مقياس الإضاءة اعتمادا على تركيبات الجينات المبلغ عنها المستخدمة. هذا المزيج من تقنية تشغيل العقل بالحقن المجهري لخصية الفأر كطرق تعداء عابرة سيوفر بالتأكيد العديد من المزايا على الأساليب الحالية مثل المعدلة وراثيا أو الفئران بالضربة القاضية. إنه يضمن أداء سريعا وتكلفة منخفضة والحاجة إلى مهارات فنية معتدلة فقط.

نأمل أن يكون هذا النهج المنهجي حكيما للتقنية المتاحة في مجال أبحاث الخصوبة عند الذكور. قد يكون مفيدا بشكل أساسي لمعالجة مجموعة واسعة من القضايا المتعلقة بالجينات التجريبية وعمليات الخصوبة. سيكون هذا ممكنا بشكل خاص عند استخدام هذه الطريقة للتحليل الجيني في شكل كسب لجميع تجارب فقدان الوظيفة.

المفترض أنه سيكون مفيدا جدا أيضا للتحقيق في العناصر التنظيمية ، على سبيل المثال ، الجينات المحددة لتكوين المنوية. لبدء الإجراء ، قم بتخدير فأر ذكر يبلغ من العمر ستة إلى ثمانية أسابيع بمزيج فردي من 10٪ كيتامين و 2٪ زيلازين تحت الجلد. ثم تأكد من أن الفأر تحت التخدير العميق عن طريق قرص أصابع القدم.

ضع مرهما على عينيه لمنع الجفاف. بعد ذلك ، قم بإزالة شعر البطن باستخدام ماكينة حلاقة كهربائية وقم بتطهير منطقة الجراحة بعد ذلك. قم بعمل شق بطني مباشرة فوق الغدد PrepU في وسط منطقة البطن.

لذلك ، اسحب الجلد وقم بإجراء قطع جلدي عرضي صغير. ثم استمر على طول الطبقة العضلية في البطن. اسحب ضمادات دهن البطن بعناية لكشف الخصية المرفقة وضعها على ورق معقم على البطن.

بعد ذلك ، استخدم مجهر استريو للعثور على قناة الأنف والأذن والحنجرة للحقن المجهري. إنه تقاطع الأوعية الدموية الدقيقة بين الخصية والبربخ ، ويقع بجوار شريان الخصية. قم بإزالة الأنسجة الدهنية التي تغطي قناة الأنف والأذن والحنجرة بالملقط الدقيق.

بعد ذلك ، ضع قناة التحرير على شريط ورقي معقم ، مما يضمن رؤية القناة بسهولة دون الإضرار بالبيئة المحيطة. علاوة على ذلك، قم بتوصيل ماصة الحقن المجهري، التي تم تحميلها بمحلول البلازميد الملون من قبل بوحدة حاقن المعالج الدقيق. بعد ذلك ، ضع إبرة الحقن الدقيقة موازية لقناة EENT مع توجيه الطرف نحو خصية REIT.

ثم استخدم ملاقط دقيقة لتجريد القناة فوق ماصة الحقن المجهري. تأكد من حفظ الماصة بالتوازي مع القناة أثناء سحبها. قم بتوجيه الإبرة بعناية نحو الخصية وتوقف تماما كما تخترق خصية REIT مباشرة أسفل الغلالة البيضاء.

بعد ذلك ، قم بتعيين معلمات الحاقن الصغير. بعد ذلك ، ابدأ في حقن محلول بناء الجين. راقب عملية الحقن بأكملها من خلال مراقبة حالة ملء الخصية.

بمساعدة محلول البلازميد الملون ، قم ببناء الخصية حتى ثلثي حجمها فقط. لتمكين التثقيب الكهربائي الفعال. انقع أقطاب الملقط في وقت واحد PBS لضمان التوصيل الكافي.

ثم اضغط على الاختبار قليلا بين الأقطاب الكهربائية الرطبة وقم بقياس المقاومة الكهربائية باستخدام الباراتا الكهربائية. بعد ذلك ، اضبط الكهرباء بشكل كاف مع التأكد من إمكانية تطبيق التيار على الخصية بإجمالي عدد ثمانية نبضات مربعة. في أربعة مواقع مختلفة للخصية ، قم بإجراء التثقيب الكهربائي بشكل شامل حول الخصية بأكملها.

بعد الانتهاء من التثقيب الكهربائي ، ضع الخصية مرة أخرى في البطن بالقرب من موقعها الأصلي قدر الإمكان. لذلك كانت الطبقة العضلية الداخلية خياطة جراحية قابلة للامتصاص. ثم أغلق الجلد بمشابك خياطة.

اسمح للفأر بالتعافي من التخدير. في صندوق معقم دافئ على وسادة حرارة 37 درجة مئوية ، محضرة ببعض المناشف الورقية. يجب أن تضمن الوسادة تسخين نصف القفص فقط مما يخلق تدرجا حراريا.

بالإضافة إلى ذلك ، قم بتغطية الماوس بورقة أخرى من المناديل الورقية لتقليل التوتر بشكل أكبر. بعد أن يستيقظ تماما ، انقله إلى قفص جديد نظيف ومجهز بالكامل. ولكن لمزيد من التعافي ، راقب عملية الاسترداد حتى تعيد الفأر أخيرا إلى منشأة.

يوضح هذا الشكل أن الخصيتين المافوقتين بأكملهما بعد ثلاثة أيام من التثقيب الكهربائي في الجسم الحي عن طريق الكشف عن التألق ، تظهر الخصيتان المنقولتان للفأر الأسود C 57 بروتين الفلورسنت الأخضر المحسن أو البروتين الفلوري الأحمر الموضح. فيما يلي الأقسام النسيجية للخصية. بعد ثلاثة أيام من التثقيب الكهربائي من جانب واحد باستخدام PE eeg ، FPC واحد ، يتم توضيح الخلايا الأنبوبية المنوية المنقولة بواسطة التألق الأخضر ، جنبا إلى جنب مع هيكلها النموذجي المنظم كرويا.

كانت نواتهم مضادة مع اثنين من المؤيدين وثلاثة باللون الأزرق. أثناء إجراء هذا الإجراء ، من المهم أن تضع في اعتبارك أن عمليات تحديد قناة الأنف والأذن والحنجرة وإطلاقها لأنسجتها الدهنية معقدة للغاية. لذلك ، يمكنك التدرب على الميتة أولا قبل تحقيق تجربة حقيقية في الجسم الحي.

بعد الإجراء المضاد للحقن الدقيق والحصاد النهائي للاختبار ، يمكن تنفيذ العديد من التقنيات مثل سفينة Q-R-T-P-C-R والنشاف الغربي. ومن ثم ، فإن جينة الاختبار هي أنماط تعبير البروتين بالإضافة إلى التعديلات اللاحقة للترجمة أمر مسلم به. لذلك من خلال هذه الأدوات ، قد تتعرض مجموعة متنوعة من الموضوعات للهجوم مثل تكوين المنوية ، على سبيل المثال ، مع آلياتها ولوائحها المعقدة الأساسية.