عزل خلايا الفئران العقدة الليمفاوية اللحمية

الهدف العام من هذا الإجراء هو عزل الخلايا اللحمية للعقدة الليمفاوية. يتم تحقيق ذلك عن طريق تعطيل كبسولة العقدة الليمفاوية أولا. في الخطوة الثانية ، يتم هضم شظايا العقدة الليمفاوية باستخدام الكولاجيناز الرابع و D nase واحد.

ثم يتم استبدال الإنزيمات بالكولاجيناز D و D nase واحد ، ويتم تصنيف الشظايا ميكانيكيا باستخدام ماصة آلية متعددة القنوات. في النهاية ، يمكن تمييز التعبير عن جزيء سطح الخلية لخلايا العقدة الليمفاوية المعزولة بقياس التدفق الخلوي. الميزة الرئيسية لهذه التقنية على الطريقة الحالية هي أنه بهذه الطريقة ، يتم هضم خلايا SHR للعقدة الليمفاوية باستخدام إجراء إنزيمي موحد يكمله التصنيف الميكانيكي الذي يحافظ على قابلية الخلايا للحياة والتعبير عن الجزيئات السطحية.

ابدأ بوضع الغدد الليمفاوية المقطعة في طبق بتري معقم يحتوي على ملليلترين من وسط مثلج. ثم استخدم حقنتين سعة مليلتر واحد مزودة بإبر قياس 25 لتعطيل كبسولات العقدة الليمفاوية. بعد ذلك ، انقل الأنسجة المعطلة إلى أنبوب مخروطي الشكل سعة خمسة ملليلتر يحتوي على 750 ميكرولتر من الوسط ، مكملا بالكولاجيناز الرابع والحمض النووي واحد وتحريك مغناطيسي.

ثم ضع الأنبوب في دورق يحتوي على ماء مسخن مسبقا بدرجة حرارة 37 درجة مئوية على محرك مغناطيسي وحرك ملاط الخلية بمعدل جولة واحدة في الثانية لمدة 30 دقيقة. بعد التحريك ، اترك جزء العقدة الليمفاوية يستقر ثم قم بإزالة المادة الطافية بعناية. الآن خصب للخلايا غير اللحمية نقل إلى شظايا العقدة الليمفاوية 750 ميكرولتر من الوسط الطازج ، مع استكمال الكولاجيناز D و D nase واحد ، ثم تحريك الأنسجة لمدة خمس دقائق أخرى عند 37 درجة مئوية.

بعد ذلك ، استخدم ماصة آلية متعددة القنوات لتفكيك شظايا أنسجة العقدة الليمفاوية بحجم 700 ميكرولتر لمدة 10 دورات بأقصى سرعة ، ثم حرك شظايا الأنسجة مرة أخرى بعد 10 دقائق. علاوة على ذلك، قم بفصل كتل الأنسجة باستخدام الماصة المؤتمتة متعددة القنوات لمدة 99 دورة بأقصى سرعة. ثم أضف 7.5 ميكرولتر من 0.5 مولار EDTA إلى الأنبوب واخلط تعليق الأنسجة لمدة 99 دورة أخرى باستخدام الماصة الآلية.

بعد دورة التصنيف الأخيرة ، أضف 750 ميكرولتر من الوسط إلى محلول الخلية وقم بتصفية الخلايا من خلال شبكة نايلون 70 ميكرومتر. ثم قم بتحبيير الخلايا لمدة خمس دقائق عند 1500 جم وأربع درجات مئوية. لتصور مجموعات الخلايا اللحمية في العقدة الليمفاوية عن طريق قياس التدفق الخلوي ، قم بتلطيخ عينات الخلايا المناسبة باستخدام متتبع ميت حي والأجسام المضادة ذات الأهمية في 100 ميكرولتر من HBSS تحتوي على 2٪ FCS لمدة 20 دقيقة على الأقل عند أربع درجات مئوية في الظلام.

ثم اغسل الخلايا في 500 ميكرولتر من HBSS باستخدام FCS وأعد تعليقها. تقوم الكريات الموجودة في 100 ميكرولتر من HBSS و FCS بتشغيل الخلايا على مقياس التدفق الخلوي الذي يخرج الخلايا الإيجابية CD 45 لاستبعاد الخلايا المكونة للدم ، ثم تمشي على مجموعة المفردة الحية. أخيرا ، ارسم GP 38 مقابل CD 31 لتصور الخلايا الشبكية في المنطقة T ، والخلايا البطانية اللمفاوية ، والخلايا البطانية الدموية ، والخلايا السالبة المزدوجة.

مجموعات الخلايا. كان العدد الإجمالي للخلايا المستعاد بعد هضم المجموعات الفرعية للخلايا اللحمية في العقدة الليمفاوية أعلى قليلا في البروتوكول الذي تم إثباته للتو مقارنة ببروتوكولات الارتباط وفليتشر مما يدل على أن صلاحية الخلايا اللحمية في العقدة الليمفاوية بعد العزل بواسطة هذا البروتوكول مماثلة لتلك التي تم استردادها باستخدام البروتوكولات المنشورة. تمت مقارنة الخلايا الشبكية في المنطقة T والخلايا البطانية اللمفاوية المعزولة عبر هذا وبروتوكولات الارتباط وفليتشر لتعبير IAB CD one 40 a CD 80 و PD L واحد و CD 40.

كان التعبير عن جميع جزيئات السطح الخمسة أعلى عند الهضم باستخدام البروتوكول الذي تم إثباته للتو وبروتوكول الارتباط لكل من المجموعتين الفرعيتين للخلايا اللحمية ، مما يشير إلى أن تدهور بعض جزيئات السطح بواسطة الكولاجيناز الرابع و D أقل قوة من مساحة الكولاجيناز p و DYS. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية عزل المجموعات الفرعية الأربعة الرئيسية لخلايا سدى العقدة الليمفاوية بنجاح مع الحفاظ على التعبير عن العديد من الجزيئات السطحية المفيدة لمزيد من التوصيف والتحليل.