تصور الإلتقام بالكلاذرين بوساطة من G مستقبلات البروتين يقترن قرار واحد في الحدث عبر الميكروسكوب TIRF

الهدف العام من هذا الإجراء هو تصور وتحديد ديناميكيات الحفر الفردية المطلية بالكلاثرين في الخلايا الحية. يتم تحقيق ذلك عن طريق نقل البروتينات الداخلية والبروتينات الشحنة ذات العلامات الفلورية أولا إلى خط خلية الالتصاق. الخطوة التالية هي تصوير الخلايا بانعكاس داخلي كلي أو مضان أو مجهر العشب.

ثم يتم تحديد عمر مجموعات صغيرة من الحفر المطلية بالكلاثرين يدويا باستخدام برنامج معالجة وتحليل الصور. تتمثل الخطوة الأخيرة في تحديد عمر الحفر المطلية بالكلاثرين عن طريق الكشف والتحليل الآلي الموضوعي. في النهاية ، يتم استخدام الفحص المجهري العشبي لتحديد ديناميكيات الحفر الفردية المطلية بالكلاثرين عند دقة حدث واحد للتحقيق في الالتقام الخلوي بوساطة الكلاثرين للمستقبلات المقترنة ببروتين G.

يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال تهريب الأغشية ، مثل كيف يمكن أن يتغير التجميع وديناميكيات الالتقام الخلوي بناء على البروتينات الداخلية المختلفة وبروتينات الشحن الموجودة. لبدء نقل HEC 2 93 خلية مع بلازميدات ترميز العلامة G ، ومستقبلات بروتين مقترنة أو GPCRs و / أو مكونات آلية Claro. في صفيحة 12 بئر كما هو مفصل في بروتوكول النص في اليوم التالي للتعداء ، أضف 0.5 مل من محلول ملحي مخزن للفوسفات أو PBS مع EDTA واحد ملليمولار لكل منهما.

حسنا ، ثم ضع ثلاث جولات معقمة 25 ملم غطاء ينزلق في آبار منفصلة من ستة. لوحة جيدة املأ كل بئر بملليلترين من الوسائط. ادفع انزلاق الغطاء برفق إلى قاع البئر لمنع الخلايا من النمو على الجانب السفلي من زلة الغطاء.

بعد ذلك ، قم بتحريك بئر من صفيحة 12 بئر يدويا لرفع الخلايا من قاع البئر. أضف ملليلتر واحدا من DM EM مع 10٪ FBS لإعادة الإرسال. ثم وزع الخلايا المرفوعة من بئر واحد بالتساوي بين زلات الغطاء الثلاثة.

اسمح للخلايا بالنمو على زلات الغطاء لمدة 48 ساعة على الأقل قبل التصوير. تأكد أيضا من أن الخلايا منتشرة ومسطحة لتصوير الحفرة المطلية بالكلاثرين وديناميكيات الشحن. أولا ، قم باحتضان الخلايا مسبقا بالأجسام المضادة كما هو موضح في بروتوكول النص.

ثم استعد لنقل زلة الغطاء إلى غرفة تصوير الخلايا الحية باستخدام زوج من الملقط وإبرة قياس 25 مثنية عند الحافة في خطاف. امسك زوج الملقط في اليد المهيمنة. امسك الإبرة المنحنية في الأخرى.

أدر الإبرة حتى ينحني الخطاف لأسفل باتجاه الزجاج. اسحب جانب خطاف الإبرة برفق لأسفل عبر قاع صفيحة من ستة آبار حتى يتم تثبيتها على زلة الغطاء. احرص على عدم خدش سطح زلة الغطاء لأنها ستفصل الخلايا.

ارفع الغطاء برفق من قاع البئر. قم بموازنة زلة الغطاء على جدار البئر للحصول على الدعم. استخدم الملقط للإمساك بالقرب من حافة زلة الغطاء وحرك جانب خلية انزلاق الغطاء لأعلى إلى غرفة التصوير.

قم بتجميع الغرفة وأضف 700 ميكرولتر من وسط التصوير الدافئ. بعد نقل الغرفة إلى المجهر ، قم بتركيز الخلايا باستخدام صورة موضوعية لغمر زيت العشب للخلايا في أوضاع الإضاءة التقليدية أو التألق أو متحد البؤر لتحديد الخلايا التي تعبر عن التركيبات المناسبة كإجراء احترازي مهم للسلامة. كن دائما على دراية بزاوية شعاع الليزر ووجهها دائما بعيدا عن المراقب.

بعد ذلك ، ركز لأسفل على السطح السفلي للخلية المعبرة حتى يختفي الخطوط العريضة لغشاء البلازما حول الخلية ويظهر السطح السفلي للخلية. يتضح هذا بشكل أكبر مع بروتين الشحن الموضعي لغشاء البلازما مثل مستقبلات mu الأفيونية. في حالة استخدام نفس الليزر للتصوير في التألق المعرف العالي التقليدي ، قم بزيادة زاوية حدوث الليزر حتى الخروج من التركيز.

يختفي التألق في الجزء الداخلي من الخلية ولا يرى أي مخطط لغشاء البلازما حول الخلية. بمجرد وصولك إلى العشب م ، تأكد من أن ليزر الإثارة ينعكس مرة أخرى من خلال الهدف وغير مرئي فوق الهدف. من خلال التحقق مما إذا كانت بقعة الليزر مرئية ، قم بتنقيح التركيز للحصول على صورة واضحة.

بمجرد تحديد الخلايا ، احصل على الصور كل ثلاث ثوان على الأقل لمدة 10 دقائق. كرر جميع الخطوات لتصوير خلايا إضافية. لبدء تحليل ديناميكيات الخلايا الداخلية ، افتح الملف في الصورة J.Images يتم تخزينها كمكدس واحد من ملفات TIFF.

مع قنوات بينية. قم بتحويل الصور إلى مكدسات فائقة عن طريق تحديد مكدسات الصور الفائقة والتكديس إلى التكديس المفرط في النافذة المنبثقة. أدخل عدد القنوات التي تم الحصول عليها.

أدخل واحدا ل Zack وأدخل عدد إطارات الفيلم. ينتج عن تنسيق المكدس الفائق نافذة بها شريطي تمرير. استخدم الشريط العلوي للتنقل عبر القنوات والشريط السفلي للتنقل عبر الوقت.

قم بالتمرير إلى قناة البروتين التي سيتم فحص عمرها. تجاوز الإطار الأول من الفيلم لتقليل إدراج الحفر المطلية بالكلاثرين الموجودة مسبقا أو CCPs التي لا تكون مدتها الكاملة مرئية. ارسم منطقة اهتمام أو عائد استثمار حول مكان تم اختياره عشوائيا.

احسب عدد الإطارات التي تكون البقعة مرئية. لبدء التحليل بالتعرف على الكائنات ، افتح ملف الصورة الأولية في برنامج تحليل الصور بشكل افتراضي. تظهر صورة ملونة.

استخدم نافذة ضبط الشاشة لضبط سطوع القناة. انقر فوق اسم القناة لتغيير اللون المعروض. قم بإلغاء تحديد المربع بجوار القناة لمنع عرضها.

قم بإنشاء أماكن بالنقر فوق الرمز الذي يحتوي على بقع برتقالية. حدد عائد استثمار حول الخلية باستخدامه لاستبعاد المناطق التي ستكتشف الحواف واللويحات الأمامية الساطعة بشكل غير صحيح. قم بقياس قطر البقعة لتوفير تقديرات أولية للخوارزمية.

قم بالتبديل إلى وضع الشريحة وانقر على الأطراف القطبية للبقعة لقياس قطرها. افعل ذلك لأربع أو خمس نقاط مستديرة تبدو مؤشرا على CCP في ذروة استقراره بعد تكوينه قبل التنازل ، استخدم هذه القياسات لحساب متوسط القطر وصولا إلى أقرب 10 ميكرون. لاكتشاف عودة البقع إلى وضع التجاوز، حدد القناة المناسبة للاكتشاف.

أدخل متوسط القطر المقاس، عادة 0.3 أو 0.4 ميكرون. انقر فوق السهم الأزرق للأمام لتحديد المواقع. قم بتصفية البقع حسب الجودة من خلال ضبط الفلتر لالتقاط أكبر عدد ممكن من البقع بدون خلفية.

يتم تحديد عامل تصفية الجودة افتراضيا. استخدم منحنى الجودة كدليل لتعيين حد مناسب. حرك العتبة السفلية للمرشح باستخدام زر الماوس الأيسر إلى هذا الانخفاض الأول في المنحنى.

هذه نقطة انطلاق جيدة للفلتر. لأن هذا الموقف عادة ما يحسن الكشف إلى البقع المرئية فقط. قم بإزالة البقع في مفتاح الشاشة في نقطة التحرير لتحديد الوضع وانقر فوق البقعة بعد أن يتحول إلى اللون الأصفر ، انقر فوق حذف.

ثم انقر فوق السهم الأزرق لمتابعة إنشاء الخوارزمية. قم بقياس المسارات عن طريق ضبط المسارات على كعكة الشوكولاتة أثناء الحركة. يجب ألا يظهر ال CCP أي حركة موجهة ، فقط الحد الأدنى من الانجراف عبر غشاء البلازما.

هذه الخوارزمية هي الأنسب لتلك الحركة. بعد ذلك ، قم بتعيين المسافة القصوى على قيمة صغيرة مثل 0.7 ميكرون. يقلل تحديد مسافة صغيرة من اتصال البقع المجاورة ولا يزال يسمح بالتتبع المستمر لبقعة الخلية من خلال حركة CCP أو الخلية.

ثم اضبط الحد الأقصى لحجم الفجوة على واحد. يسمح هذا للمسار بالاستمرار في حالة فقدان إطار واحد فقط. في التعاقب ، تؤدي أحجام الفجوات التي تزيد عن ثلاثة إلى ربط مسارات مختلفة معا بشكل غير صحيح.

الخطوة التالية هي تبديل عرض المسار إلى ذيل التنين. قم بالتمرير خلال الفيلم مع ملاحظة جودة الكشف. إذا تم توصيل البقع المجاورة ، فقم بتقليل المسافة القصوى إلى أقل من 0.7 ميكرون.

إذا تم تفكيك البقع بسهولة كبيرة ، فقم بزيادة الحد الأقصى لحجم الفجوة. انقر على السهم الأزرق لإنشاء المسارات. يؤدي هذا إلى شاشة مسار التصفية لتصفية المسارات.

استخدم مرشح الشدة لإزالة اللويحات الساطعة الإضافية. ثم استخدم مرشح الإزاحة لإزالة الجسيمات الداخلية التي تدخل حقل العشب. توخي الحذر لأن البقع الأطول سيكون لها إزاحة أطول أيضا.

انقر فوق السهم المزدوج الأخضر لإكمال البروتوكول. لتصدير البيانات ، انتقل إلى علامة التبويب الإحصائيات. انقر فوق رمز القرص المرن الفردي لتصدير الإحصاء المحدد.

انقر فوق الرمز الذي يشبه سلسلة من الأقراص المرنة لتصدير جميع الإحصائيات. يكشف التركيز على غشاء البلازما الملتصق والوضع متحد البؤر عن خلية مليئة بالمضان الخافت. في المقابل ، يكشف التركيز على مركز الخلية عن غشاء البلازما كحلقة من التألق حول الخلية.

يصبح التألق البؤري الخارجي واضحا عند التبديل إلى epi التقليدي أو التألق أو العشب بزاوية غير صحيحة. عندما تكون زاوية العشب صحيحة ، يكون غشاء البلازما هشا للغاية وواضحا ومشرقا وخارج التركيز. لم يعد التألق يعطل الصورة.

عندما يكون استيرتين بيتا في بركة العصارة الخلوية ، يكون هناك القليل جدا في مجال العشب ويبدو ضبابيا وتركيزا خارجيا. بمجرد تنشيط MOR بواسطة ناهض ، بيتا ، يتم تجنيد العقار في غشاء البلازما وإعادة توزيع كل من بيتا والمستقبلات إلى CCPs. يتم تحديد عمر هذه المجموعات يدويا.

باستخدام المعلمات الثلاث للالتقام الخلوي المكتمل ، يمكن أن تختفي البقع التي تشير إلى CCPs تومض تماما ، أو تضغط على بنية أكبر. يظهر هنا تم اكتشاف CCPs باستخدام MAs بعد التصفية لإزالة هياكل البلاك غير الديناميكية ، تم أيضا استبعاد الكرات البيضاء المتراكبة ، والإشارة إلى البقع المكتشفة ، والبقع الخافتة التي لا يمكن اكتشافها طوال حياتها باستخدام مرشح الجودة. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد حقا لكيفية تصور الحفر المشفرة بالقسطرة الفردية باستخدام الفحص المجهري للعشب.