تحليل السريع للشذوذ الكروموسومات في الخلايا الليمفاوية B الماوس بواسطة PNA-FISH

الهدف العام من التجربة التالية هو تحديد عدم الاستقرار الجيني في الخلايا الليمفاوية B للفأر. يتم تحقيق ذلك عن طريق عزل الخلايا البائية أولا لزراعة الخلايا الأولية. بعد ذلك ، يتم إصلاح الخلايا لتسهيل تحضير انتشاءات الطور.

أخيرا ، يتم إجراء أسماك التيلومير PNA لتصور التيلوميرات المسماة بالفلورسنت. في النهاية ، يمكن تحديد مستوى الأنواع المختلفة من انحرافات الكروموسومات عن طريق الفحص المجهري الفلوري. يمكن أن تؤدي الآثار المترتبة على هذه التقنية إلى توسيع فهمنا لمسارات إصلاح الحمض النووي ، حيث يمكن أن تساعد في تحديد الجينات التي تعزز الاستقرار الجيني في نماذج الفئران المستهدفة.

على الرغم من أن هذه الطريقة يمكن أن توفر نظرة ثاقبة لفواصل الكروموسومات وإعادة ترتيب الكروموسومات الكبيرة الأخرى ، إلا أنه يمكن أيضا تكييفها لقياس أشكال أخرى من عدم الاستقرار الجيني مثل عمليات الانتقال. لعزل الخلايا البائية ، ابدأ بوضع طحال معزول حديثا في طبق زراعة أنسجة 35 ملم يحتوي على ملليلترين من محلول الغسيل في غطاء التدفق الرقائقي. ثم استخدم الواجهة الخلفية للمكبس من حقنة خمسة ملليلتر لنقع الطحال برفق.

بعد ذلك ، قم بتصفية ملاط الأنسجة من خلال مصفاة شبكية من النايلون 70 ميكرومتر في أنبوب سعة 50 مليلتر باستخدام المكبس للضغط برفق على القطع الكبيرة من الأنسجة من خلال المصفاة. اشطف الطبق والحقنة بثمانية ملليلتر من محلول الغسيل ، وقم بتصفية الغسيل من خلال المصفاة. ثم بعد تدوير الخلايا ، قم بتحريك الحبيبات لأعلى ولأسفل عدة مرات في ثلاثة ملليلتر من المخزن المؤقت لتحلل CK.

بعد خمس دقائق ، أوقف التفاعل باستخدام 10 ملليلتر من محلول الغسيل. ثم بعد تدوير الخلايا مرة أخرى ، انقر فوق الجزء السفلي من الأنبوب لإعادة تعليق الحبيبات وإضافة مليلتر واحد من مخزن الغسيل إلى الخلايا. بعد ذلك ، احتضان الخلايا ب 50 ميكرولترا من الخرز الصغير المضاد للقرص المضغوط 43 كحد أقصى على الجليد.

بعد 30 دقيقة ، اغسل الخلايا برفق في 10 مل من محلول الغسيل. أثناء الطرد المركزي ، ضع عمودا صغيرا على المغناطيس وأنبوبا مخروطي الشكل 15 مليلترا أسفل العمود. ثم أضف ملليلترا واحدا من المخزن المؤقت للغسيل إلى العمود ، وجمع EIT في الأنبوب.

أعد تعليق حبيبات الخلية في مليلتر واحد من المخزن المؤقت للغسيل ، ثم قم بتحميل الخلايا على العمود بعد تشغيل العينة ، اشطف العمود بمليلتر واحد من المخزن المؤقت للغسيل وأضف سبعة ملليلتر من مخزن الغسيل المؤقت مباشرة إلى العينة التي تم جمعها. بعد عد الخلايا التي تم جمعها ، انقلها إلى أنبوب سعة 50 مليلتر للطرد المركزي. ثم لتنشيط الخلايا البائية ، أعد تعليق الحبيبات في مرة واحدة 10 من الخلايا الست لكل مليلتر في وسط الخلية البائية المكمل واحتضان الخلايا في ستة ألواح بئر عند خمسة ملليلتر من الخلايا لكل بئر في حاضنة لثقافة الخلايا المرطبة عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون لإصلاح الخلايا البائية.

بعد ذلك عند 50 ميكرولتر من الآبار لكل بئر. بعد حضانة لمدة ساعة عند 37 درجة مئوية ، انقل الخلايا البائية إلى أنبوب 15 ملليلترا. قم بتغطية الملصق بشريط لاصق وقم بتدوير الخلايا.

ثم استنشق كل ما عدا حوالي مليلتر واحد من المادة الطافية وأعد تعليق الحبيبات عن طريق سحب العينات. أضف خمسة ملليلتر من 37 درجة مئوية ، كلوريد البوتاسيوم ، قطرة قطرة أثناء النبض على دوامة. ثم أضف 10 مل إضافية من كلوريد البوتاسيوم واخلط محلول الخلية عن طريق الانعكاس.

بعد ذلك ، احتضان الخلايا في حمام مائي 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة. ثم أضف خمس قطرات من الخلط المثبت الطازج مرة أخرى عن طريق قلبه. ثم قم بتدوير الخلايا بعد إعادة التشكيل بتعليق الحبيبات في مليلتر واحد من المادة الطافية ، وأضف خمسة ملليلتر من المثبت الطازج ، قطرة قطرة أثناء النبض على دوامة واحتضان الخلايا و 10 ملليلتر إضافي من المثبت في درجة حرارة الغرفة.

بعد 30 دقيقة ، قم بتكسير الخلايا وقم بإزالة كل المليلتر باستثناء مليلتر واحد من المثبت. ثم بعد غسل الخلايا ، مرتين أخريين في 15 مل من المثبت ، أعد تعليق الحبيبات في آخر 70 ميكرولتر من المادة الطافية. الآن ضع الشرائح المصنفة بزاوية 35 درجة في غرفة الرطوبة مضبوطة على 22.9 درجة مئوية و 52٪ رطوبة.

قم بإسقاط 35 ميكرولترا من الخلايا البائية المعلقة على كل شريحة ، وقم بإعداد شريحتين لكل عينة. ثم بعد ترك الشرائح تجف في غرفة الرطوبة لمدة 30 دقيقة ، قم بتخزين الشرائح في صندوق منزلق على حرارة 37 درجة مئوية حتى تجف تماما. بمجرد أن يجف ، استخدم قلما ماسيا لتمييز مساحة 18 × 18 ملم للتهجين على ظهر كل شريحة لتشويه طبيعة الشرائح للأسماك.

بعد ذلك ، ضع 120 ميكرولترا من أميد الشكل منزوع الأيونات بنسبة 70٪ على زلات غطاء 24 ملم × 60 ملم ، ثم المس كل شريحة على زلة الغطاء. قم بتغيير طبيعة الشرائح على لوح تسخين 80 درجة مئوية لمدة 90 ثانية ، ثم قم بالتمرير بسرعة وبعناية من زلات الغطاء وعلى التوالي. ضع الشرائح في مكان مثلج بارد 70 و 90 و 100٪ إيثانول لكل منهما لمدة ثلاث دقائق بعد أن تجف الشرائح ، ضع الشرائح في غرفة رطبة وقم بتطبيق مسبار ما قبل الحاجة على المناطق المحددة على الشرائح.

قم بتغطية مزيج المسبار بزلة غطاء مقاس 18 × 18 ملم واحتضان الشرائح عند 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة. ثم اغسل الشرائح في اثنين من XSSC تحذير مسبقا مع الاهتزاز. بعد خمس دقائق ، ضع 35 ميكرولترا من وسط التثبيت المويال على الشرائح.

قم بتغطية الوسط بزلات غطاء مقاس 24 ملم × 60 ملم وقم بتخزين الشرائح عند أربع درجات مئوية. أخيرا ، قم بتحليل شرائح الطور باستخدام مجهر مضان epi قياسي. يجب أن تشكل كروموسومات الطور المشتقة من خلية فأر واحدة مجموعة سرية تحتوي على 40 كروموسوما.

يحتوي كل كروموسوم على سنترومير في أحد طرفيه ، بالقرب من إشارتي تيلومير ، بالإضافة إلى إشارتين إضافيتين من التيلومير في الطرف الآخر من الكروموسوم. فواصل الكروماتيد هي فواصل في أحد الكروماتيدات الشقيقة التي تشكل كل كروموسوم طوري. في بعض الحالات ، يمكن ملاحظة الطرف المكسور للكروموسوم كجزء به إشارات تيلومير في نفس انتشار الطور الطوري.

الكروموسومات الراديوية هي عمليات إعادة ترتيب معقدة تتضمن كروموسومين. قد تنضم الكروموسومات أيضا لتشكيل كروموسومات ثنائية المركز ، والتي تظهر على شكل اندماجات شاملة من الكروموسومات مع السنتروميرات في كلا الطرفين. عمليات نقل روبرتسونيان هي نوع من الإزاحة بين السنتروميرات لكروموسومين ، والتي تظهر على شكل أربعة أذرع كرومات شقيقة متصلة بسنترومير واحد.

في هذه الصورة الأخيرة ، يتم عرض طور فوقي لا يحتوي على إشارات تيلومير. يمكن أن يحدث غياب إشارات التيلومير من أخطاء في تحضير المسبار أو من فقاعات الهواء تحت زلة الغطاء أثناء التهجين. باتباع هذا الإجراء ، يمكن إجراء طرق أخرى مثل تحليل دورة الخلية ومعلومات القولون للإجابة على أسئلة إضافية مثل ما إذا كان عدم الاستقرار الجيني المتزايد يؤثر على بقاء الخلية.