نظام الثقافة الماوس الجنين الأمعاء الجامعة ل فيفو السابقين التلاعب في مسارات إشارات وتصوير لايف ثلاثي الأبعاد التنمية الزغبة

الهدف العام من هذا الإجراء هو تنمية مزارع أعضاء كاملة من الأمعاء الجنينية للفأر ، خارج الجسم الحي ، مما يسمح بتعديل مسارات إشارات الخلية. يتم تحقيق ذلك عن طريق حصاد أمعاء الفئران أولا من الأجنة بين اليوم الجنيني 12.5 إلى 18.5. الخطوة الثانية هي وضع الأمعاء في مزرعة الوحل أو لوحة ثقافة التصوير الحي.

بعد ذلك ، عالج الأمعاء بوسائط محضرة بالمثبطات الدوائية لمسارات إشارات الخلية أو المكان. سرعات aro غارقة في البروتينات المؤتلفة لتغيير إشارات الخلية فوق الأمعاء. الخطوة الأخيرة هي تصوير الأمعاء المستنبتة إما في أقسام فيومي سميكة أو ثقب.

في النهاية ، يتم استخدام التصوير متحد البؤر متبوعا بإعادة البناء ثلاثي الأبعاد ، لتصور كيف أثر تعديل مسارات إشارات الخلية على تطور طبقات الأنسجة أثناء تكوين الزغابات. يعد العرض البصري لهذه الطريقة أمرا بالغ الأهمية لأن الأنسجة الجنينية حساسة للغاية وتتطلب عناية كبيرة أثناء التشريح والمناولة. للتحضير للتشريح ، انقع أدوات التشريح في 70٪ من الإيثانول.

ضع طبق ثقافة الآبار الستة وأطباق بتري 10 سم مع وسائط BGJB على الجليد. ثم قم بإزالة الأمعاء من الأجنة القتل الرحيم. قم بتشريحها واحدة تلو الأخرى في واحد X-D-P-B-S.

قم بإزالة الطحال بعناية من المعدة ، ثم البنكرياس من المعدة والاثني عشر العلوي. بعد ذلك ، افصل الثرب برفق ، واتركه متصلا قدر الإمكان ، وافصل الوصلات بما يكفي فقط للسماح بتقويم الأمعاء. ثم ضع العينات في صفيحة بتري 10 سم مع وسائط BGJB العاملة.

بعد ذلك ، استخدم ماصة الفم لنقل القطع المعوية إلى الآبار في لوحة الزاعقة. قم بإزالة الوسائط من أسفل البئر. ثم أضف 700 ميكرولتر من وسائط المعالجة تحت العبرة.

حسنا ، بعد ذلك ، أضف 300 ميكرولتر من وسائط العلاج بالتنقيط على الأمعاء ، واتركها تمتص عبر البئر. قم بتغيير وسط العلاج مرة واحدة على الأقل يوميا أو أكثر اعتمادا على عمر النصف لكاشف العلاج. بدلا من ذلك ، ضع الخرزات الزراعية برفق على الأمعاء باستخدام ماصة الفم بإبرة شعرية مسحوبة.

ضع الخرزات بحذر شديد لأن المناولة الخشنة ستتلف الأمعاء وتمنع تطور الزغابات في المنطقة المصابة. في هذا الإجراء ، قم بتضمين الأمعاء في 7٪ من القوالب البلاستيكية الصغيرة ، واترك كتل aros تبرد وتتصلب. بعد ذلك ، قم بإزالة كتل aros من القوالب البلاستيكية.

قم بلصق كتل aros على مرحلة جمع Vibram بالغراء الفوري. بعد ذلك ، املأ مرحلة التجميع بالثلج البارد X-D-P-B-S. قطع الأقسام بسمك 100 إلى 150 ميكرومتر.

ثم انقل الأقسام من مرحلة التجميع إلى بئر من ستة آبار للتخزين عند أربع درجات مئوية. لإعداد الشرائح للتركيب ، ضع شريطا على الوجهين على طول الشريحة الطويلة لكل شريحة. ضع قطرة XPBS واحدة عليها.

ثم ضع بعناية من خمسة إلى 10 أقسام على الشريحة. افتح جميع الأقسام وانشرها على طبقة واحدة. عبر الشريحة.

قم بإزالة أي أجزاء زائدة أو أجزاء غير مستوية من شأنها أن تمنع انزلاق الغطاء بشكل مسطح. استخدم بعناية مناديل المختبر لامتصاص فائض XPBS من حول الأقسام. بعد ذلك عند قطرة من وسط التركيب المائي أعلى الأقسام.

ثم ضع الغطاء فوقه وأغلقه على الشريحة باستخدام vap المذاب. بعد ذلك ، قم بتصوير أقسام viome إما على مجهر متحد البؤر في وضع مستقيم أو مقلوب. استخدم الآن الغراء الفوري للالتصاق بغشاء بولي كربونات فردي بشاشة شبكية دقيقة.

ضع الشاشة الشبكية في وسط لوحة الثقافة. ثم ضع الأمعاء المقطعة على غشاء البولي كربونات وأضف قطرة من الغراء الفوري إلى كل من الأطراف. بعد ذلك ، أضف وسائط الثقافة الخالية من الفينول الأحمر أسفل غشاء البولي كربونات في البئر الأوسط للوحة الثقافة.

أضف الماء إلى الحافة الخارجية للوحة الثقافة لتوفير الرطوبة. نظرا لأن أمعاء الجنين تخضع لموجات انقباض مثل التمعج في الثقافة ، أضف 100 ميكرولتر من محلول الزيلازين إلى ثلاثة ملليلتر من الوسائط في البئر الأوسط من الصفيحة للتحكم في حركة الأمعاء أثناء التصوير. قم بإجراء التصوير المباشر باستخدام مجهر مضان متحد البؤر ثنائي الفوتون على حامل عمودي.

تظهر هنا المقاطع العرضية لأنسجة الاثني عشر التي تم حصادها حديثا E 14 و E 15 و E 16 الملطخة ب ecat هنا و dpi. تم حصاد هذا الجزء المعوي في E 14 وزراعته لمدة يومين. في E 14 ، كانت الظهارة غير النموذجية لا تزال طبقية زائفة.

بعد يومين في الثقافة السابعة ، تظهر ، على الرغم من تأخرها قليلا مقارنة بالسابع. في E 16 ، إليك إعادة بناء ثلاثية الأبعاد للأقسام البصرية للأوعية الدموية الملطخة ب pcam في الاثني عشر E 14 ، ويوضح هذا الشكل إعادة بناء ثلاثية الأبعاد للصور متحدة البؤر من الأمعاء المقطعة E 15.5 viome التي كانت ملطخة بالتألق المناعي للأجسام المضادة. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تشريح الأنسجة الجنينية ، وإعداد الأمعاء لزراعة الأعضاء بأكملها ، وإعداد الأنسجة للتصوير ثلاثي الأبعاد عالي الجودة.