المتعدد الوسائط البصرية الميكروسكوب طرق كشف ورم الأنسجة الصرف والبنية في منطقة البحر الكاريبي المرجانية بناء المرجان

الهدف العام من التجربة التالية هو تصوير سلائل مرجانية بسمك واحد إلى ملليمترين في 3D لفهم البنية الدقيقة وكذلك أصباغ المرجان وتوطينها. يتم تحقيق ذلك عن طريق تضمين العينة أولا في الشمع ، ثم تقطيع العينة إلى أقسام ميكرون واحد باستخدام ميكروتوم. بعد ذلك ، يتم استخدام تقنية وجه كتلة تسلسلية مصممة خصيصا لتصوير الاورام الحميدة المرجانية وإعادة بناء الصورة ثلاثية الأبعاد.

باستخدام صور ثنائية الأبعاد متعددة ، يتم الحصول على نتائج تظهر قدرة التقنية على حل التفاصيل الهيكلية الدقيقة للأنسجة المرجانية دون المساس بسلامتها الهيكلية. إظهار الإجراء. اليوم سيكون الدكتور موندي سيفا المعلم ، المتعاون مع مجموعتي البحثية.

لتحضير شمع الترشيح المسبق ، قم بإذابة 3.6 جرام من التوجيه في رقائق في دورق زجاجي على طبق ساخن. بعد ذلك ، أضف 400 ملليغرام من السودان. أربعة لتقليل تألق خلفية الشمع ، اخلطي جيدا وانتظر حتى يتم الحصول على محلول أحمر شفاف.

ثم أضيفي 81 جراما من البارافين واخلطيهم جيدا. بعد ذلك ، أضف 15 جراما من شريط VI الحبيبي الأبيض وقم بإذابه تماما في نفس الدورق بمجرد الذوبان ، اخلطه مرة أخرى للحصول على محلول شمع مختلط تماما.

أضف الآن الخليط إلى زجاجة زجاجية وأغلقه بغطاء غير محكم. ضع الزجاجة في فرن حراري 60 درجة مئوية للحفاظ على المكونات في حالة سائلة وحدوث جميع عمليات التسلل. يمكن صنع هذا المحلول إلى 200 مل وتقسيمه إلى زجاجتين سعة 100 مل.

تم جمع عينات واحدة للتسلل والأخرى للتضمين النهائي لبناء الشعاب المرجانية في منطقة البحر الكاريبي من الاتحاد الأفريقي ومثبتة في بارا فورمالديهايد في الحقل. لتضمين الأنسجة المرجانية ل SBFI ، اغسل أولا الاورام الحميدة المرجانية التي تم جمعها في الحقل وقم بتخزينها عند أربع درجات مئوية في فارمالديهايد. بعد ذلك ، اغسلها في PB S3 مرات لمدة خمس دقائق في كل مرة عندما تكون جاهزة للتصوير.

قم بإزالة الكلس من الاورام الحميدة في محلول Cal Two لمدة 24 ساعة أو حتى تخلو الاورام الحميدة تماما من كربونات الكالسيوم. احتضان العديد من الاورام الحميدة المرجانية منزوعة الكلس ككتلة واحدة في سلسلة 25 و 50 و 75 و 100٪ من الإيثانول متبوعة بواحد x xylene. استبدل لمدة 30 دقيقة كل جلسة لتجفيف العينات.

بعد ذلك ، ضع الاورام الحميدة المعالجة في 100٪ زيلين. استبدلها في فرن 65 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. بعد ذلك ، استبدلها بمحلول طازج واحتضنها لمدة 30 دقيقة أخرى.

قم بتوجيه الاورام الحميدة بحيث تكون القمم متجهة لأسفل والسطح مسطحا قدر الإمكان. قم بعمل حلول من اثنين إلى واحد ، واحد إلى واحد ، وواحد إلى اثنين. بديل الزيلين وشمع الترشيح المسبق.

في 50 مليلتر ، تحتضن أنابيب Falcon الاورام الحميدة المرجانية مع هذه التركيزات الثلاثة المتزايدة من شمع الترشيح المسبق ، تليها ثلاث حضانات في شمع ما قبل الترشيح بنسبة 100٪ لمدة 30 دقيقة إلى ساعة واحدة في كل مرة. الآن انقل العينة إلى شمع التضمين. قم بإزالة شمع التضمين بعد 30 دقيقة ، ثم استبدله بشمع التضمين الطازج واستمر في الحضانة لمدة أربع ساعات على الأقل عند 65 درجة مئوية.

بعد ذلك ، قم بتصوير الكتلة. يعد هذا ضروريا لأنه بمجرد تضمينه في الشمع ، سيصبح موقع العينة غير مرئي لأن الشمع الأحمر المدمج معتم. بعد ذلك ، ضع قطرات صغيرة من الشمع عالي نقطة الانصهار حول قالب التضمين الجديد المصنوع من الفولاذ المقاوم للصدأ المسخن مسبقا واتركه يبرد.

صب كمية صغيرة من الشمع المذاب حديثا والفراش من اللقب الثاني وضع الورم المرجاني متجها لأسفل فوق نقطة الشمع الأبيض بسرعة. ثم ضع حامل عينة بلاستيكي على صينية الفولاذ المقاوم للصدأ واسكب المزيد من شمع التضمين بحيث يصل الشمع إلى سطح القالب البلاستيكي. الآن أخرج الإعداد بالكامل من الفرن الذي تبلغ درجة حرارته 65 درجة مئوية واتركه يبرد على مقعد أو سطح بارد حتى يتماسك الشمع تماما.

بعد ذلك ، ضع الكتلة المجففة في الثلاجة عند أربع درجات مئوية ، محمية من الضوء للتخزين طويل الأجل لتقسيم الكتلة. أولا ، قم بقصها وقطع أقسام ميكرون واحد. باستخدام ميكروتوم ، التقط صورة وجه الكتلة الأملس ، والذي يحتوي على العينة.

كل مرة. عند إزالة قسم ، تظهر العينة عندما يبدأ الشمع الأبيض في الاختفاء. ثم التقط الصور بكاميرا أحادية اللون باستخدام مرشح فلورسنت متواضع لالتقاط التألق الذاتي للكروماتوفور أو صورة الورم المرجاني ، من ثلاثة إلى أربعة نوى منزعة الكلس من كل عينة.

لإجراء تصوير مضان الفوتون ، ضع نوى السلائل المرجانية المغسولة في 4٪ بارا فورمالديهايد رأسا على عقب في طبق سفلي زجاجي مغطى باستخدام ليزر فوتونين عند صورة إثارة 780 نانومتر من ثلاثة إلى أربعة سلائل بتكبيرين مختلفين باستخدام هدف 10 ×. بعد ذلك، استخدم وضع مسح البلاط لتجميع ما يقرب من 25 إلى 100 صورة لكل مستوى بؤري في XY على فترات 10 أو 20 ميكرون. ثم اجمع 50 إلى 100 صورة من خلال المحور Z على فترات 10 أو 20 ميكرون ، والتي ستكون حوالي 5،000 إلى 10،000 صورة إجمالية لكل ورم مرجاني.

بعد تلك الصورة ، ثلاث إلى أربع مناطق سليلة لتمثيل الأنواع الأساسية والشعاب المرجانية. ثم قم بتخزين جميع الصور بتنسيق البيانات الأولية على القرص الصلب للنظام. في هذا الإجراء ، قم بقص البيانات ثنائية الأبعاد لتقليل حجم الملف من خلال التركيز على ورم واحد باستخدام أداة الاقتصاص المربع وتجميعها كملف TIF واحد.

في برنامج الاستحواذ. افتح الملفات المجمعة لبيانات SBFI أو مكدسات Z المتعددة المبلطة لقسمين بصريين فوتونيين في وحدة برنامج EMERIS تتجاوز تحت مشروع خوارزمية الحجم ، وبيانات SBFI المقدمة في 3D. باستخدام إسقاط الظل ، قم بإنشاء وضع ISOSURFACE حيث تكون voxels عتبة لإنشاء نمط سطح صلب.

تصور الإسقاطات ثلاثية الأبعاد باستخدام خوارزمية قص عادي في أوضاع XY xz و YZ المتعامدة للكشف عن الهيكل ثلاثي الأبعاد وشكل الشعاب المرجانية. ثم قم بتحريك الإسقاطات باستخدام وحدة الرسوم المتحركة للإطار الرئيسي. في نفس برنامج erris ، قم بإنشاء ملفات فيديو بضغط 5٪ وإنشاء مقاطع أفلام بتنسيق VI باستخدام طريقة الحجم ثلاثية الأبعاد ومتساوي السطح.

فيما يلي صورتان ثلاثي الأبعاد لأورام الاورام الحميدة المرجانية من M Anis و M fa Lata. تم التقاط هاتين الصورتين بدون فصل طيفي للمكونات باستخدام إثارة 780 نانومتر من ليزري الفوتون مع الإشارة الضوئية التي تم جمعها من 450 إلى 700 نانومتر ، وتم جمع هاتين الصورتين بنفس الإثارة ، ولكن تم استخدام كاشفين لأنبوب مضاعف الصور في وقت واحد لجمع البيانات من مكونين ، أحدهما من 500 إلى 550 نانومتر والآخر من 650 إلى 720 نانومتر. هذه صور مغلفة بعمق.

الأحمر هو الضحلة والأزرق هي أعمق المكونات في 2D. نعم. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر تحضير عينة الشمع الأحمر بشكل صحيح. يسمح الجمع بين تصوير الوجه التسلسلي والقدمين على الفحص المجهري الفلوري بتحليل تصبغ المرجان والبنية الخلوية على مجموعة متنوعة من مقاييس العدسات.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية التعامل مع الشعاب المرجانية وتصويرها وخصائصها الطيفية في ثلاثة أبعاد.