الثقافات شريحة عضوي النمط لدراسة ديناميات دبقية قليلة التغصن وتكون الميالين

الهدف العام من هذا الإجراء هو التحقيق في تكاثر وتمايز خلايا سلالة قليلة التغصن في بيئة تشبه إلى حد كبير ما هو موجود في الجسم الحي. يتم تحقيق ذلك عن طريق تحضير ثقافات شرائح من أربعة أدمغة ومخيخ من الفئران المعدلة وراثيا المبكرة بعد الولادة. ثم يتم تصوير الخلايا المفردة في الشرائح على مدى ساعات إلى أيام لتصور الديناميكيات الخلوية لتكاثرها وتمايزها.

بعد التصوير ، يتم استخدام الكيمياء المناعية اللاحقة للخلايا لتحديد الخصائص الخلوية المختلفة. في النهاية ، يمكن أن تظهر النتائج ديناميكيات تكاثر الخلايا وتمايزها في ظل الظروف العادية وبعد التلاعب الدوائي أو الجيني. الميزة الرئيسية لهذه التقنية على الطرق الحالية مثل الفحم المنفصل ومزارع الخلايا العصبية وخلايا النسب الليجا هي أن المزارع الشرائح تسمح بالتلاعب بالبيئة اللاخلوية مع الحفاظ على بنية الأنسجة cyto.

جميع الإجراءات الحيوانية الإرشادات وقد تمت الموافقة عليها من قبل لجنة رعاية واستخدامه المؤسسية في جامعة كونيتيكت قبل ساعتين على الأقل من التشريح. قم بإعداد إدخالات ثقافة الأنسجة في ستة ألواح جيدة لكل منها. حسنا ، أضف ملليلترا واحدا من وسط زراعة الشرائح ، ثم انقل الصفائح إلى حاضنة زراعة الخلايا عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون قبل 15 دقيقة على الأقل من التشريح.

ضع المخزن المؤقت للتشريح على الجليد وابدأ في غليه بنسبة 95٪ أكسجين ، 5٪ غاز ثاني أكسيد الكربون. تأكد أيضا من تعقيم جميع الأدوات ومفرمة الأنسجة بنسبة 70٪ من الإيثانول. انقل الأنسجة إلى طبق معقم مقاس 35 ملم يحتوي على عازلة تشريح أكسجة مثلجة باردة.

بعد ذلك ، باستخدام شفرة حلاقة ، قم بقطع المخيخ والدماغ الأمامي بقطع سهمي وسط الدماغ الأمامي والمخيخ الذي يفصل نصفي الكرة الأرضية. الآن باستخدام المروحية اليدوية ، اصنع قسما إكليليا وسهميا بسمك 300 ميكرون من الدماغ والمخيخ الأربعة. ينتج كل عادة ست شرائح من الدماغ وأربع شرائح وست شرائح من المخيخ.

من الناحية المثالية ، يأخذ شرائح تمتد على الثلث الأمامي من الجسم الثفني من أجل دراسة كل من مناطق المادة الرمادية والبيضاء في نفس الشريحة. انقل الشرائح المنفصلة إلى مخزن مؤقت للتشريح البارد فقاعات حديثا على الجليد في المخزن المؤقت ، باستخدام ملعقة تشريح أو وزن صغيرة. افصل الأقسام الفردية وانقلها إلى ما قبل التحضين.

ستة أطباق بئر تحتوي على إدراج ثقافة. يمكن وضع شريحتين إلى ثلاث شرائح على ثقافة واحدة. أدخل ماصة من أي مخزن مؤقت للتشريح الزائد من سطح المزرعة.

أدخل الألواح وانقلها إلى الحاضنة حتى يتم إصلاحها. يجب استبدال وسط الشريحة بعد يوم واحد من تحضير الشريحة ، ثم كل يومين حتى تثبيت الشريحة كما هو مذكور في البروتوكول. اعتمادا على التجربة ، استخدم الشرائح بعد خمسة إلى سبعة أيام.

في الثقافة. استخدم فقط الشرائح التي تصبح شفافة بعد الأيام القليلة الأولى وتخلص من تلك التي تحتوي على مناطق غير شفافة غير مستوية مرئية للعين المجردة. تحت تباين الوجه ، تظهر هذه المناطق غير الشفافة على شكل كتلة من الخلايا الداكنة.

إذا تم إجراؤها بشكل صحيح ، تحدث المناطق غير الشفافة الميتة في ما لا يزيد عن واحد إلى 5٪ من الشرائح. لإجراء تصوير بفاصل زمني لتكاثر الخلايا والتمايز من خليتين من NG ، استخدم شرائح عمرها ثلاثة إلى خمسة أيام من الفئران التي تعبر عن EGFP في خليتين من NG. لا تدع الشرائح تقل عن 37 درجة مئوية لأكثر من 15 دقيقة.

في جلسة تصوير ، مع إبقاء اللوحة مغلقة ، استخدم هدف 10 × لمجهر مضان مقلوب لالتقاط الصور في المرة الأولى. نقطة الثقافة. قم بتصوير أربعة إلى ثمانية مواقع على كل شريحة من مناطق المادة الرمادية والبيضاء في الشريحة.

أيضا ، قم بتصوير معالم مفيدة مثل حواف الشرائح أو خلايا معينة أو اتجاه مسارات المادة البيضاء لأغراض النقل. يمكن استخدام صورة النقطة الزمنية السابقة كصورة مرجعية أثناء النقل لانقسام خليتين NG وتمايز الخلايا قليلة التغصن. التقط الصور كل أربع إلى ست ساعات لمدة خمسة إلى سبعة أيام بشكل مثالي.

إذا تم استخدام العلامة المحفزة NG two cre ، ER YFP ، فقم بتحفيز تعبير المراسل باستخدام وسط الثقافة مع 100 نانو ضرس. يجب أن تظهر أربعة هيدروكسي تاموكسيفين مذاب في نشاط مراسل الإيثانول في غضون يوم إلى يومين. للتثبيت ، أضف ملليلترا واحدا من المثبت إلى قاع الثقافة.

أدخل وأضف ملليلتر آخر فوق الشرائح. لا تقم برش المثبت مباشرة على الشرائح وإلا فقد تنفصل. ثبت الأنسجة لمدة 30 دقيقة عند أربع درجات مئوية ثم باستخدام مشرط.

اقطع الأغشية مع الشرائح المرفقة. باستخدام الملقط ، انقل الشرائح بعناية إلى آبار فردية من صفيحة 24 بئر محملة ب PBS. بعد ذلك ، انقل الشرائح إلى صفيحة ثانية مكونة من 24 بئر محملة بمحلول مانع يحتوي على 5٪ مصل ماعز عادي و 0.1٪ تريتون × 100 في PBS.

اسمح لهم بالتحتضن في محلول الحجب لمدة ساعة في درجة حرارة الغرفة. بمجرد حظرها ، انقل الشرائح إلى لوحة محملة بجسم مضاد أولي في PBS مع 5٪ NGS. اسمح لهم بالحضانة طوال الليل عند أربع درجات مئوية في اليوم التالي.

اغسل الشرائح في PBS. ثم احتضان الشرائح بالأجسام المضادة الثانوية في PBS بنسبة 5٪ NGS. دع الحضانة تذهب لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة.

اتبع ذلك بثلاث غسلات أخرى في PBS كما كان من قبل وقم بتركيب الشرائح بحيث يكون الغشاء المواجه للشريحة بحيث لا يكون بين الهدف والأنسجة. لتحليل الديناميكيات الزمنية لتمايز الخلايا قليلة التغصن ، تم الحصول على صور لتقسيم خليتين من خلية NG من مزارع شرائح الدماغ الأمامي من P ثمانية NG اثنين من الفئران المعدلة وراثيا زاحفة على مدار عدة أيام ، تم التقاط تسلسلات الفاصل الزمني على مدار 122 ساعة. تم تحديد النمط الظاهري للخلايا المقسمة باستخدام الأجسام المضادة NG two و CC واحد.

تم تقييم تكاثر الخلايا أيضا باستخدام تلطيخ كيميائي مناعي لعلامة تكاثر الخلايا. تم إجراء رسم خرائط الطعم KI 67 لخليتين من NG بعد تحريض إعادة تركيب CRE في شرائح من NG اثنين من الفئران CRE YFP. بعد يومين من إضافة أربعة هيدروكسي تاموكسيفين.

تم العثور على مراسل YFP يعبر عن NG خليتين إيجابيتين في الثقافات. بعد أربعة أيام ، تمايزت نسبة من هذه الخلايا إلى خلايا CC واحدة إيجابية قليلة التغصن. تم تصوير الخلايا قليلة التغصن الناضجة في مزارع شرائح المخيخ من P-L-P-D-S.

كانت الخلايا العصبية بيركين النخاعية للفئران الحمراء موجودة في هذه الثقافات. أظهر التصوير المتكرر إضافة النخاع DS الأحمر الذي يعبر عن كيمياء الخلايا الدبقية قليلة التغصن في هذه الشرائح تعبيرا كبيرا عن بروتين المايلين الأساسي. أخيرا ، كشف التصوير عالي الدقة الزمنية عن أجسام خلايا قليلة التغصن مستقرة مع بعض الحركات الطفيفة في العمليات البعيدة.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تحضير مزارع الشرائح من كل من الدماغ الأربعة والمخيخ بشكل متكرر لتصوير الخلايا المفردة بشكل متكرر على مدار أيام إلى ساعات وتحليل مصير خلايا الصورة باستخدام الكيمياء المناعية بعد ذلك. بالإضافة إلى التصوير ، تسمح هذه الشرائح أيضا بالتلاعب بالبيئة الخلوية أثناء استخدام تقنيات رسم خرائط المصير مثل إعادة تركيب الكريم المحفز في شريحة محضرة.