تحسن في جل β-القضاء الشامل للO-ربط وسلفو-glycomics الاختزالية التي كتبها الطيف الكتلي

الهدف العام من هذا الإجراء هو حصاد Olink Glycans. يتم تحقيق ذلك عن طريق حل البروتينات السكرية أولا بواسطة صفحة SDS. الخطوة الثانية هي غسل قطع الجل التي تحتوي على البروتين السكري المهم.

بعد ذلك ، يتم إطلاق جليكان أولينك عن طريق التخلص من بيتا المختزل. الخطوة الأخيرة هي الجليكان لكل مثيلة مع تقسيم الطور. في نهاية المطاف ، يتم تحليل الجليكان الميثيلي بيرم عن طريق قياس الطيف الكتلي الترادفي للكشف عن الهياكل وتحديد الوفرة.

الميزة الرئيسية لهذه التقنية على الطرق الحالية مثل الكروماتوغرافيا السائلة عالية الأداء ، هي أن طريقتنا تفصل بين الجليكان المحايد والمشحون لكل جليكان ميثيل في قسم طور سريع. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال علم الجليكو من خلال السماح بالتوصيف الشامل للجليكانات أو المرتبطة المنبعثة من البروتينات السكرية التي تم حلها. قبل البدء في هذا الإجراء ، قم بحل البروتينات السكرية باستخدام الرحلان الكهربائي الهلامي.

بعد الرحلان الكهربائي ، ضع الجل على لوح زجاجي واستئصال المنطقة محل الاهتمام باستخدام مشرط نظيف لزيادة محصول OG glycans. انقل شريط الجل المثير للاهتمام إلى طبق زجاجي آخر وقم بتقطيع القطعة إلى مكعبين ملليمتريين تقريبا. انقل قطع الجل الصغيرة إلى أنبوب زجاجي علوي لولبي 13 × 100 ملم مع ملعقة صغيرة من الفولاذ المقاوم للصدأ.

بعد ذلك ، أضف ملليلتر واحد من بيكربونات الأمونيوم 25 ملليمولار أو أمبي إلى أنبوب العينة. بعد تغطية الأنبوب بغطاء علوي لولبي من خط تفلون ، امزج المحتويات برفق عن طريق النقر على الأنبوب قبل تركه يقف لمدة 10 دقائق. ثم قم بإزالة المحيط بعناية من الأنبوب الزجاجي.

باستخدام مرعى أو ماصة زجاجية ، أضف ملليلتر واحد من نتريل الأسيتو إلى الأنبوب الزجاجي لتغطية قطع الجل بالكامل. بعد تغطية الأنبوب ، امزج المحتويات برفق عن طريق النقر على الأنبوب قبل تركه يقف لمدة 10 دقائق. عند الانتهاء ، قم بإزالة نتريل الأسيتو من الأنبوب الزجاجي.

بعد تكرار الخطوات السابقة حتى يتم التخلص من اللون الأزرق الفاتح ، أضف ملليلترين من أسيتات الإيثيل وأعد تلخيص الأنبوب. ضع الأنبوب عند أربع درجات مئوية طوال الليل مع تحريك نهاية المطاف. بمجرد إزالة غسل أسيتات الإيثيل ، قم بإجراء ثلاث غسلات بملليلترين من الماء منزوع الأيونات.

بمجرد تجفيف قطع الجل ، أضف 500 ميكرولتر من محلول هيدروكسيد الصوديوم 100 مللي مولار. ودعونا نقف لمدة ثلاث إلى خمس دقائق على الجليد لموازنة الجل مع الظروف الأساسية التي تعزز استعادة الجليكان. بعد ذلك ، أضف 500 ميكرولتر من اثنين من هيدريد بورو الصوديوم المولي في 100 مللي مولار هيدروكسيد الصوديوم ، مما ينتج عنه تركيزات نهائية من هيدريد بورو الصوديوم المولي في 100 مللي مولار.

بعد خلط الأنبوب برفق ، احتضن العينة عند 45 درجة مئوية لمدة 18 ساعة. خلال الساعة الأولى من الحضانة ، امزج الأنبوب برفق كل 15 دقيقة. بعد اكتمال تفاعل التخلص من بيتا ووضع الأنبوب على الجليد ، أضف ببطء 10٪ من حمض الأسيتيك بالتنقيط.

لتحييد القاعدة ، قم بدوامة أنبوب العينة برفق بين إضافات حمض الأسيتيك ، وقم بالطرد المركزي للأنبوب للتخلص من الفقاعات ومنع الانتشار إذا لزم الأمر. لعمل عمود زجاجي صغير ، خدش وكسر طرف المراعي أو الماصة الزجاجية باستخدام قاطع سيراميك بحيث يبلغ طول طرف الماصة المستدقة سنتيمترا واحدا تقريبا. بعد إغاظة سدادة من الصوف الزجاجي ، ادفعها نحو الحافة ، لتشكيل دعامة لطبقة الراتنج.

قم بتأمين عمود الماصة بدبوس ملابس وضعه فوق أنبوب اختبار زجاجي. بعد ذلك ، اغسل الماصة الفارغة التي تحتوي على الصوف الزجاجي بمليلتر واحد من الميثانول وثلاثة ملليلتر من حمض الأسيتيك 5٪. بعد تحريك ملاط راتنج تبادل الكاتيون Dow X في 5٪ حمض الخليك.

انقل ما يكفي منه لإنتاج حجم طبقة مليلتر واحد في عمود ماصة المراعي ، واشطف العمود باستخدام خمسة أحجام من حمض الأسيتيك بنسبة 5٪ للتحقق من التدفق من خلاله لظهور جزيئات الراتنج. بعد وضع العمود فوق أنبوب زجاجي علوي لولبي جديد مقاس 16 × 125 ملم ، قم بتحميل العينة على العمود. بمجرد جمع التدفق ، قم بمسح الجليكان بثلاثة أحجام على الأقل من حمض الأسيتيك 5٪ في نفس الأنبوب.

بعد التجميد ، أضف 300 ميكرولتر من حمض الخليك بنسبة 10٪ في الميثانول إلى أنبوب العينة المجفف. بعد الدوامة ، قم بإزالة باتة ثلاثي ميثيل الناتجة عن طريق التبخر تحت تيار نيتروجين عند 37 درجة مئوية. بعد تكرار خطوات إعادة التعليق والتجفيف أربع مرات على الأقل ، أعد تكوين العينة في 5٪ حمض الأسيتيك.

بمجرد تحميل العينة على عمود C 18 متوازن ، اجمع التدفق في أنبوب غطاء لولبي زجاجي مقاس 13 × 100 ملم. قم بإزالة جليكان OOG بثلاثة ملليلتر من حمض الأسيتيك 5٪ في نفس الأنبوب. ثم قم بتجميد العينة لتحضير الكاشف الأساسي لمثيلة التجعيد.

أضف 400 ميكرولتر من هيدروكسيد الصوديوم بنسبة 50٪ إلى أنبوب علوي لولبي زجاجي نظيف مقاس 13 × 100 ملم. ثم أضف 800 ميكرولتر من الميثانول اللامائي إلى نفس الأنبوب. أضف أربعة ملليلتر من أكسيد ثنائي ميثيل كبريت اللامائي والدوامة لتوليد راسب أبيض.

الطرد المركزي العينة عند 600 مرة G لمدة دقيقة واحدة لتكبيل الرواسب. بعد التخلص من المادة الطافية وإضافة أربعة ملليلتر من أكسيد ثنائي ميثيل كبريت اللامائي إلى دوامة الحبيبات ، كرر الكاشف أربع مرات أخرى حتى يصبح الملاط الأساسي شفافا. قم بإذابة القاعدة المحببة في ثلاثة ملليلتر من أكسيد ثنائي ميثيل كبريت اللامائي ، واخلطها برفق عن طريق سحب العينة لأعلى ولأسفل باستخدام ماصة المراعي النظيفة.

بعد ذلك ، أضف 200 ميكرولتر من أكسيد ثنائي ميثيل كبريت اللامائي إلى العينة المجففة والدوامة. لتعليقه ، أضف 300 ميكرولتر من الملاط الأساسي المعلق إلى العينة ، وأضف على الفور 100 ميكرولتر من غاز الميثان ITOM. أغلق الأنبوب بغطاء مبطن بالتفلون واخلطه بقوة لمدة خمس دقائق بواسطة دوامة.

لإيقاف تفاعل مثيلة بيرم ، ضع الأنبوب على الجليد وأضف ملليلترين من حمض الخليك بنسبة 5٪. بعد الدوامة، قم بتحريك الماصة للمحلول لأعلى ولأسفل خمس مرات لتقليل الحجم المتبقي من غاز الميثان ITOM عن طريق التبخر. في هذه المرحلة ، أضف ملليلترين من ثنائي كلورو الميثان إلى العينة بعد الدوامة والطرد المركزي.

انقل الطبقة المائية العلوية إلى أنبوب زجاجي جديد مقاس 13 × 100 ملم. بعد تكرار الغسيل المائي لطبقة ثنائي كلورو الميثان ، امزج المرحلة المائية الثانية مع الطبقة المائية الأولى. بمجرد تكرار غسل الماء لمرحلة ثنائي كلورو ميثان مرتين إلى ثلاث مرات ، انقل طور ثنائي كلورو ميثان إلى أنبوب زجاجي نظيف بماصة مراعي نظيفة.

ثم جفف المرحلة العضوية تحت تيار نيتروجين عند 42 درجة مئوية. بعد موازنة عمود C 18 وتحميل الطبقة المائية عليه. اغسل العمود C 18 بالماء ثم قم بإزالة الجليكان الميثليته في أنبوب زجاجي جديد مع ملليلترين من 50٪ Aceto Nitrile يحلل بيرم OG glycans عن طريق التسريب المباشر في مطياف الكتلة المناسب باستخدام مصدر رش كهربائي نانوي بمعدل تدفق حقنة من 0.4 إلى 0.6 ميكرولتر في الدقيقة عند 210 درجة مئوية.

درجة حرارة الشعيرات الدموية للتجزئة عن طريق التفكك الناجم عن الاصطدام في MSM S و MS متعدد الأبعاد لأداة مصيدة الأيونات تطبق 30 إلى 40٪ من أطياف الكتلة الممثلة لطاقة الاصطدام لعينات جليكان أولينك الميثيل المنبعثة من الميوسين البقري باستخدام التخلص من بيتا المختزل هنا في اللوحة العلوية. يهيمن على الأطياف ملوثات مشتتة بولي مشتقة من هلام بولي أكريلاميد. توضح اللوحة السفلية أن غسل أسيتات الإيثيل لقطع الجل قبل التخلص من بيتا يزيل هذه المشكلة.

تم إطلاق الجليكانات المقطعة من الميوسين البقري تحت الفك العلوي عن طريق التخلص من بيتا المختزل من إنجل باستخدام قطع هلام تم تقطيعها إما إلى شرائح صغيرة أو كبيرة. كان استرداد الجليكان المغطى من قطع الهلام الصغيرة أكبر بعشرة أضعاف تقريبا من شرائح الهلام الكبيرة. يتم استرداد الجليكان الميثيلي المحايد في مرحلة ثنائي كلورو الميثان العضوي.

الجليكان الميثيلي من الناحية الكريمة إلى مرحلة الماء. تسهل كفاءة وبساطة طريقة تقسيم الطور بشكل كبير إنتاجية العينة والأساليب التحليلية اللاحقة. تم استرداد الجليكان O الميثليته غير الكبريتات من المرحلة العضوية ، وتم استرداد جميع الجليكان الميثيلي من المرحلة المائية ، مما يسهل تحديد وتوصيف الجليكان الميثوليته من إيزوبار تقريبا وعدم الكبريت

تختلف هذه الجليكانات بمقدار 0.1 وحدة كتلة فقط وسيكون من الصعب حلها دون الفصل المادي بين النوعين حسب تقسيم الطور بعد تطوره. سمحت هذه التقنية باستكشاف شامل لتنوع الجليكان في عينات الأنسجة والخلايا المستنبتة وأنظمة النماذج وعينات المرضى. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية راحة اليد وتقسيم جميع الجليكانات المرتبطة المنبعثة من بروتينات gly بنجاح.

تم الحل بواسطة صفحة SDS.