الكشف عن البديل خلال الربط طلائي-الوسيطة الانتقالية

الهدف العام من التجربة التالية هو اكتشاف التغييرات في الربط البديل أثناء EMT. يتم تحقيق ذلك من خلال استخدام نموذج EMT المحفز الذي يتم فيه التعبير عن تطور بروتين الانصهار. في الخلايا الظهارية الثديية البشرية تحفز الخلايا على الخضوع ل EMT عند العلاج بتاموكسيفين كخطوة ثانية.

يتم تحليل التعبير عن الأشكال الإسوية لللصق بواسطة R-T-P-C-R الكمي باستخدام مجموعات أولية محددة متساوية الشكل ، والتي تكشف عن تغييرات التضفير البديلة على مستوى الحمض النووي الريبي. بعد ذلك ، يتم تحديد وفرة البروتين المقابل لكل شكل إسوي عن طريق النشاف المناعي من أجل تأكيد التعبير عن الأشكال الإسوية لللصق على مستوى البروتين ، ويتم الحصول على النتائج التي تظهر التغيرات في التضفير البديل في الجينات ذات الأهمية أثناء EMT ، بناء على تحليلات R-T-P-C-R الكمية والنشاف المناعي ، يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال التضفير البديل RN و EMT ، مثل كيفية تنظيم التضفير البديل أثناء EMT وكيف تؤثر هذه اللائحة على العمليات المرضية المتعلقة ب EMT و EMT. الآثار المترتبة على هذه التقنية هي الوقوف على علاج السرطان لأن EMT يلعب دورا مهما في تعزيز غزو الورم والورم الخبيث.

على الرغم من أن هذه الطريقة يمكن أن توفر نظرة ثاقبة للربط البديل أثناء EMT. يمكن أيضا تطبيق طريقة الكشف عن MRA المحدد في الأنظمة الأخرى ، مثل دراسة التضفير البديل في تمايز الخلايا العصبية وموت خلايا البرنامج. تتمثل الخطوة الأولى في صفيحة الخلايا التي تعبر عن بروتين اندماج ER الملتوي بذرة الخلايا في طبق زراعة أنسجة 10 سم في مكررة بعد ذلك ، قم بإعداد وحماية محلول تاموكسيفين للحث على الانتقال الوسيط الظهاري أو معالجة EMT للخلايا ب 20 نانومولار يحتوي على مادة تاموكسيفين لمجموعة تحكم غير معالجة بعقار مضاف بإضافة 0.01٪ من الإيثانول إلى مجموعة إضافية من الخلايا بعد يومين من الحضانة.

التقط صورا تحت المجهر الضوئي بتكبير 10 × لتسجيل أي تغييرات مورفولوجية. بعد ذلك ، اغسل الخلايا باستخدام PBS البارد. اكشط الخلايا من نصف اللوحة إلى مخزن مؤقت لتحلل الحمض النووي الريبي لعزل الحمض النووي الريبي والنصف الآخر في 100 ميكرولتر من محلول ريبا البارد المثلج لتحليل البروتين ، وقم بتمرير الخلايا من كلتا المجموعتين كما هو موضح سابقا وعالجها باستمرار ب 20 نانومولار تاموكسيفين أو مركبة.

كرر هذه الخطوات كل يومين حتى اليوم 14 ، وفي ذلك الوقت يجب أن تظهر خلايا الطوارئ الملتوية المعالجة بتاموكسيفين مورفولوجيا اللحمة المتوسطة على شكل مغزل. في حين أن أدوات التحكم المعالجة بالمركبات يجب أن تحافظ على الحجر المرصوف بالحصى مثل التشكل الظهاري. هنا يتم استخدام أربعة exon prem NNA كمثال للكشف عن إدراج exon.

صمم برايمر أمامي داخل exon المتغير ثلاثة وبرايمر عكسي داخل exon التأسيسي القريب أربعة. السماح بالتضخيم المحدد للإكسون المتغير المتضمن الشكل الإسوي لتضخيم أحداث تخطي exon على وجه التحديد. تصميم بادئات تمتد على تقاطع exon التأسيسي الثاني و exon أربعة والتي كان من الممكن تدميرها عند تضمين exon المتغيرة ثلاثة.

صمم التمهيدي الآخر داخل exon الأربعة التأسيسي للكشف عن إجمالي النصوص للجين وتجنب منتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل المضخم من الحمض النووي الجيني أو بادئات prem NA.Design داخل اثنين من exons التأسيسية عندما تكون جاهزا. يتبع إجراءات استخراج الحمض النووي الريبي القياسية لعزل الحمض النووي الريبي من عينات الخلايا التي تم جمعها مسبقا. تحديد تركيز وجودة الحمض النووي الريبي عن طريق امتصاص الأشعة فوق البنفسجية لتصنيع أول حبلا CD NA إعداد تفاعلات النسخ العكسي في حجم نهائي قدره 20 ميكرولترا.

قم بإجراء تفاعلات RT عند 42 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة ، تليها الحضانة عند 70 درجة مئوية لمدة خمس دقائق. لتعطيل إنزيم RT في الوقت الفعلي. أعد تفاعل البوليميراز المتسلسل 20 ميكرولتر يتكون من 10 ميكرولتر من مزيج رئيسي أخضر إلكتروني ، و 0.1 إلى 1.0 ميكرولتر من قالب CD NA وخمسة بادئات للأمام والعكس.

قم بتشغيل تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الفعلي مع 40 دورة في ثلاث نسخ. تحقق من منحنيات التفكك وتأكد من ملاحظة ذروة واحدة لكل مجموعة أولية. احصل على قيم دورة القياس الكمي عن طريق حساب قيم المشتقات الثانية لمنحنيات التضخيم.

احسب الكمية النسبية للرنا المرسال المستهدف في العينات المستحثة مقارنة بالعينة غير المستحثة باستخدام طريقة دلتا دلتا CQ كما هو موضح في هذه الصيغة. اترك الخلايا التي تم جمعها لتحليل البروتين على الجليد لمدة 10 دقائق تقريبا قبل الطرد المركزي وجمع المادة الطافية. بعد تحديد تركيز البروتين ، قم بتخفيف العينات في تحميل SDS ، وقم بتخزين 20 إلى 40 ميكروغراما من البروتينات وتحميلها في 10٪ من المواد الهلامية لصفحة SDS.

قم بتشغيل المواد الهلامية لصفحات SDS بسعة 20 مللي أمبير لمدة 1.5 ساعة. بعد هذا الوقت ، انقل البروتينات إلى أغشية PVDF في نظام نقل رطب عند أربع درجات مئوية لمدة ثلاث ساعات عند 85 فولت. اضبط وقت النقل وفقا للوزن الجزيئي للبروتينات المستهدفة.

بعد ذلك ، قم بسد الغشاء في 5٪ من الحليب الخالي من الدسم لمدة 30 دقيقة إلى ساعة واحدة. في درجة حرارة الغرفة ، احتضن الغشاء بجسم مضاد أولي عند أربع درجات مئوية بين عشية وضحاها. يتعرف الجسم المضاد الأساسي على الحاتمة في منطقة طلاء exon التأسيسية ويكتشف الأشكال الإسوية للشرائح في وقت واحد بناء على أحجام البروتين المختلفة.

في الوقت نفسه ، راقب EMT عن طريق النشاف المناعي. لعلامات EMT. استخدم eec و ahern و gamma catenin و occludin كعلامات ظهارية و fibronectin n cadherin و menton كعلامات وسيطة.

في اليوم التالي ، اغسل الغشاء ثلاث مرات باستخدام TBST على فترات خمس دقائق. بعد ذلك ، احتضان الغشاء بجسم مضاد ثانوي مترافق HRP في تخفيف من واحد إلى 10،000 لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. بعد هذا الوقت ، اغسل الغشاء ثلاث مرات باستخدام TBST كل خمس دقائق.

أخيرا ، تصور البروتينات باستخدام نظام الكشف عن التلألؤ الكيميائي وتعريض الغشاء لفيلم التصوير الشعاعي التلقائي. تميز EMT الناجم عن الالتواء بالانتقال من النمط الظاهري المرصوف بالحصى مثل النمط الظاهري الظهاري إلى النمط الظاهري الليفي الممدود ، مما يعرض عدم وجود علامات ظهارية ، e cadherin ، جاما كاتينين ، وأكلودين ، وتنظيم علامات اللحمة المتوسطة ، و fibronectin n cadherin ، و vimentin. علاوة على ذلك ، تم تقييم EMT من خلال فقدان توطين EC cadherin عند تقاطعات الخلايا الخلوية الموضحة.

فيما يلي تصميمات التمهيدي للكشف عن الأشكال الإسوية للصق CD 44. يشار إلى المواقع التمهيدية بالأسهم الملونة المختلفة. تشير نتائج تحليلات Q-R-T-P-C-R إلى انخفاض كبير في CD 44 V mRNA وزيادة في CD 44 s mRNA بعد 14 يوما من العلاج TAM.

على النقيض من ذلك ، ظل النسخة الإجمالية ل CD 44 دون تغيير أثناء EMT بما يتفق مع نتائج Q-R-T-P-C-R ، انخفض مستوى البروتين في CD 44 V بشكل ملحوظ ، في حين تم تنظيم التعبير عن بروتين CD 44 s بشكل كبير أثناء حضور هذا الإجراء. من المهم أن تتذكر أن الحث الناجح للأنف والأذن والحنجرة أمر بالغ الأهمية. وبالتالي ، يجب تأكيد الأنف والأذن والحنجرة بعناية بطرق مختلفة مثل الكشف عن التغيرات في شكل الخلايا والتعبير عن علامات الأنف والأذن والحنجرة وتوطين RIN على سطح الخلية.

باتباع هذا الإجراء ، يمكن إجراء طرق أخرى مثل فحص إدارة مراسل الربط للإجابة على أسئلة إضافية مثل ، كيف تؤثر هذه العناصر الفاعلة وعوامل التعامل على تنظيم الربط البديل بعد تطويره؟ مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال بيولوجيا الحمض النووي الريبي والبيولوجيا التنموية وبيولوجيا السرطان لاستكشاف تنظيم التضفير البديل في عمليات EMT أثناء التطور الطبيعي ورم خبيث للسرطان.