Name: في المختبر إعادة تشكيل مجمعات خفيفة حصاد النباتات والطحالب الخضراء (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 55 s
Description: تعلم إعادة تشكيل مجمعات خفيفة حصاد النباتات والطحالب الخضراء في المختبر باستخدام بروتين APA المعبر عنه في E. coli. تتيح هذه الطريقة تحليل الخصائص الطيفية للمجمعات المعاد تشكيلها.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

تم دعم هذا العمل من قبل مجلس الأبحاث الأوروبي من خلال منحة ERC للبدء / التوحيد إلى RC ومن قبل المؤسسة الهولندية للبحث في المادة (FOM) عبر برنامج FOM (10TM01).

يعلن أصحاب البلاغ عدم وجود تضارب في المصالح

بروتينات غشاء ليست سهلة حتى للدراسة. عزل بروتينات غشاء الأم معقد بسبب الحاجة إلى ذوبان طبقة ثنائية الدهون مع المنظفات، التي يمكن أن تتلف البروتينات وإزالة العوامل المساعدة الأساسية. قد تكون هذه البروتينات موجودة أيضا عند مستويات منخفضة في الأغشية البيولوجية، أو تكون مختلطة مع البروتينات ترتبط ارتباطا وثيقا، كما في حالة المجمعات الحصاد الخفيفة، التي تجعل تنقية المجمعات واحدة صعبة. مغاير التعبير البروتين في E. القولونية وإعادة المختبر توفر إمكانية تجنب هذه المشاكل. في المختبر وإعادة تنقية النتائج البروتينات مطوية في المجمعات التي تمتلك خصائص مشابهة جدا لتلك المجمعات الأم 20،21،23، وبالتالي يمكن استخدامها لدراسة المجمعات التي لا يمكن تنقيته لالتجانس 24 - 27. يستخدم هذا الأسلوب السبانخ، وهو بسهولة attainabلو مدار السنة، كمصدر لمجموع كاروتينويد الصباغ والاستعدادات. لبعض reconstitutions البروتينات الأم إلى الطحالب، ويفضل استخدام أصباغ تنقيته من الطحالب بسبب التراكيب الصباغ مختلفة. وشيلي أ / ب نسبة ونسبة شيلي / سيارة لا يزال هو نفسه بغض النظر عن مصدر الصباغ. من المهم أن ندرك أن كفاءة إعادة عادة حوالي 35 28٪. وبالتالي فمن الضروري إزالة أصباغ غير منضمة وصميم بروتيني تكشفت من الحل بعد إعادة. ويرد بروتوكول تنقية من خطوتين في هذا البروتوكول (انظر النتائج أيضا). ومع ذلك، تجدر الإشارة إلى أن الخطوة التدرج السكروز لا يسمح الفصل التام بين الاشتقاق وهولو البروتين. بالنسبة لمعظم التحليلات هذه ليست مشكلة، لأن صميم بروتيني لا يحتوي على أصباغ وبالتالي لا تتداخل مع القياسات الوظيفية. ومع ذلك، في حال كان من الضروري إزالة تماما صميم بروتيني من الابعمل تتضمن مجمع تشكيلها (على سبيل المثال، لحساب الصباغ إلى البروتين رياضيات الكيمياء)، يمكن استخدام عمود الصرف أنيوني (انظر Passarini وآخرون 2009 29 للحصول على التفاصيل). القدرة على refold البروتينات المؤتلف حصاد الضوء مع أصباغ معزولة في المختبر يوفر فرصة ل&quot;التلاعب&quot; المجمعات عن طريق تعديل إعادة تشكيل &quot;البيئة&quot; بطرق مختلفة، وبالتالي تغيير خصائص معقدة الناتجة عن ذلك. على سبيل المثال، تغيير تشكيل الصباغ خلال إعادة يمكن أن يؤدي في مجمع مع تكوين الصباغ غيرت. ويمكن استخدام هذه الميزة لدراسة تأثير مختلف الصبغات لها على بنية واستقرار المجمع. عادة إعداد الصباغ الحصول عليها من السبانخ يحتوي على نسبة شيلي أ / ب من 3: 1 ونسبة / سيارة شيلي من 2.9: 1. هذا ينتج عادة نسبة البروتين أعيد مع نفس الخصائص كما نسالبة واحدة. ومع ذلك، يمكن تعديل نسبة شيلي أ / ب بإضافة تنقية شيلي A أو B تؤثر ربط أصباغ مختلفة بسبب الانتقائية من مواقع الربط متفاوتة 30 - 33. وهذا ممكن لأن معظم المواقع الصباغ ملزم لا انتقائية تماما لشيلي في شيلي أو ب، ولكن يمكن أن تستوعب كلا، على الرغم من تقارب مع مختلف 10،30،34. بطريقة مماثلة، وعرضت مواقع الربط كاروتينويد أيضا أن تكون قادرة على استيعاب أكثر من الأنواع كزانتوفيل 8،35 - 38. وترد reconstitutions مختلف من CP26، مجمع الصباغ البروتين أخرى من النباتات العليا، وذلك باستخدام مختلف التراكيب الصباغ في الجدول 2 39. واستخدمت هذه reconstitutions لتقييم تقارب من مواقع معينة أصباغ 39 ملزمة. ومن المثير للاهتمام أن نلاحظ أنه من أجل الحصول على مجمع بنفس الصباغ جomposition باعتبارها واحدة الأصلي، يجب أن تكون نسبة داا / ب من مزيج الصباغ 3: 1. يبدو أن هذا هو الحال بالنسبة لجميع المجمعات المصادم من النباتات العليا 20،40. مزيج من البيولوجيا الجزيئية مع تقنية إعادة يسمح خصائص مجمع شيلي ملزم لدراستها بمزيد من التفصيل. أهمية البروتين المجالات المختلفة على استقرار وقابلة للطي من المجمعات، أو مشاركتهم في البروتين البروتين التفاعلات، وقد تم تحديد من قبل اقتطاع صميم بروتيني أو أداء الطفرات العشوائية 8،41 - 44. بقايا حمض أميني واحد مهمة لتنسيق أصباغ مختلفة يمكن تغييرها من خلال الطفرات الموجهة الموقع من أجل تحليل خصائص أصباغ الفردية أو تقييم مساهمتها في وظيفة واستقرار معقدة 10،28،29،45 - 52. الشكل 6 يبين إعادة تكوين Lhcb4 (CP29) معطفرة من الحامض الاميني في موقف 216 53. مقارنة بين تكوين الصباغ من wildtype والمجمعات متحولة تبين أن طفرة يستحث فقدان شيلي جزيء واحد، مشيرا إلى أن الموقع المستهدف يستوعب لشيلي في مجمع WT. الاختلافات من أطياف امتصاص WT ومتحولة، على تطبيع إلى المحتوى الصباغ، ويظهر أيضا خصائص امتصاص الصبغة المفقودة. في هذه الحالة، يمكن رؤية الفرق في ذروة الرئيسية في 680 نانومتر، مشيرا إلى أن شيلي منسقة من قبل His216 يمتص في هذا الطول الموجي (لمزيد من التفاصيل حول هذا المسخ والخصائص الطيفية MOZZO يرى آخرون 2008 53). كما يمكن استخدام تحليل طفرة لتحديد تأثير البيئة على الخواص الطيفية للأصباغ 54. في الختام، حصاد البروتينات الخفيفة يمكن بسهولة إعادة تشكيل في المختبر مما أدى الصباغ-البروتيناتن المجمعات مع خصائص مشابهة جدا لالمجمعات الأصلية. في هذه الطريقة، يتم استبعاد صعوبات عزل البروتينات الأم، بينما كان يلقى أيضا إعداد البروتين مع ارتفاع العائد والنقاء لمزيد من الدراسة. وأكد داا نسبة 1 أ / ب في إنتاج مجمع أصيلة، وقدمت أمثلة من wildtype تشكيلها وLHCs متحولة لتوضيح تطبيقات هذه التقنية: أهمية وجود 3.

جهاز التمثيل الضوئي للنباتات والطحالب تشمل البروتينات التي تربط الغشاء لا يتجزأ من الكلوروفيل (شيلي) أ، ب (شيلي ب) والكاروتينات (سيارة). هذه المجمعات الصباغ البروتين تنشط في مجال الطاقة ضوء الحصاد ونقل أن طاقة الإثارة إلى مراكز رد فعل، حيث يتم استخدامه للترويج تهمة الفصل 2. وهم يشاركون أيضا في آليات التغذية المرتدة التنظيمية التي تحمي الجهاز من التلف الضوئي ضوء ارتفاع 3،4. تتكون المجمعات حصاد الضوء (LHCs) من عائلة كبيرة من البروتينات ذات الصلة في النباتات والطحالب 5. تنقية متجانسة من كل عضو من أعضاء الأسرة وقد تعقدت من الخصائص الكيميائية والفيزيائية مشابهة إلى حد كبير من المجمعات. بالإضافة إلى ذلك، غالبا ما تؤدي الإجراءات تنقية في فقدان أصباغ أو العوامل المساعدة الأخرى المحتملة مثل الدهون. في المختبر تمثيلا إعادةTS وسيلة قوية للتغلب على هذه المشاكل. وأعيد تشكيل LHC المرتبطة الضوئي الثاني (LHC-II) لأول مرة في المختبر بواسطة Plumley وشميت في عام 1987 1. استخراج الباحثون delipidated البروتين وأصباغ بشكل منفصل من البلاستيدات الخضراء النباتية، ومن ثم الجمع بين الحرارة التشويه والتحريف بروتين مع أصباغ في وجود ليثيوم دوديسيل كبريتات (LDS)، تليها ثلاث دورات التجميد والذوبان 1. وأظهر الباحثون أن الخصائص الطيفية للمجمعات المصادم أعيد كانت مشابهة جدا لمجمعات تنقيته من النباتات. سهولة إعادة تشكيل المصادم المجمعات الصباغ البروتين، من المحتمل بسبب بعض المتأصلة ميزة التجميع الذاتي، جنبا إلى جنب مع صعوبة في عزل المجمعات المنقى من الكائنات الحية، أدى إلى اعتماد سريع للطريقة قبل باحثين آخرين. وقد تحقق إعادة تشكيل البروتينات الضوئي overexpressed في القولونية (E. كولاي) عن طريق بولسن وزملاؤه في عام 1990 6. في E.وعادة ما ترد القولونية والبروتينات الغشاء overexpressed في الهيئات إدراج، الذي مرافق تنقية بهم. ويتحقق من خلال إعادة تمسخ الحرارة الهيئات إدراج تحتوي على البروتين المؤتلف في وجود LDS، تليها إضافة أصباغ الذي يبدأ البروتين للطي. للطي من مجمع LHCII هي عملية من خطوتين: أولا، لا بد من الكلوروفيل في أقل من 1 دقيقة. ثانيا، لا بد الكلوروفيل ب واستقرت على مدى عدة دقائق 7. بالإضافة إلى توفير نظرة ثاقبة على ديناميات قابلة للطي، في إعادة المختبر جنبا إلى جنب مع الطفرات الموجهة الموقع قد يسمح بتحديد الأحماض الأمينية محددة هامة للاستقرار (على سبيل المثال، 8،9) أو التنسيق الصباغ (على سبيل المثال، 10). وقد حددت التلاعب refolding الظروف من خلال تعديل معايير مثل تكوين الصباغ أو المنظفات أيضا عناصر criticaلتر للطي السليم، مثل شرط من Xanthophylls للمجمع LHCII (على سبيل المثال، 1،11). وبالإضافة إلى ذلك، فإن التحقيق في خصائص أصباغ الفردية منضمة إلى المجمعات الممكن استخدام المجمعات تشكيلها في الجسم الحي (على سبيل المثال، 10). الطريقة الموصوفة هنا يبدأ عزل الصبغات (الكلوروفيل والكاروتين) من السبانخ والطحالب الخضراء كلاميدوموناس reinhardtii. التعبير وتنقية البروتين LHC من E. القولونية في شكل هيئات إدراج بعد ذلك بالتفصيل، تليها إعادة تشكيل LHC وتنقية اللاحقة ني عمود النسب. في الخطوة النهائية، وتنقيته المجمعات أعيد مزيد من السكروز التدرج الطرد المركزي لإزالة أصباغ حرة وتكشفت صميم بروتيني. يمثل هذا البروتوكول إجراء الأمثل دمج العديد من التعديلات التي أدخلت من قبل مختبرات مختلفة خلالالوقت 1،6،10،12 -14.

<table><tbody><tr><td>HisTrap HP</td><td>GE Healthcare</td><td>17-5247-01</td><td></td></tr><tr><td>قماش نايلون&nbsp;</td><td></td><td></td><td>20 & مو م المسام</td></tr><tr><td>الفنانين الناعمين فرشاة الطلاء&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NONIDET P-40</td><td>Sigma</td><td>74385</td><td></td></tr><tr><td>Beta-DM</td><td>Sigma</td><td>D4641</td><td></td></tr><tr><td>DNAase</td><td>ThermoScientific</td><td>EN0525</td><td></td></tr><tr><td>مساحيق الحليب</td> RNAase <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>ThermoScientific</td><td>EN0531</td><td></td></tr><tr><td>Sonicator</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Octyl & - D-glucopyranoside</td><td>Sigma</td><td>O8001 &nbsp ؛</td><td></td></tr><tr><td>جهاز طرد مركزي فائق XL</td><td>Beckman-Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TAP متوسط</td><td></td><td></td><td>انظر المرجع 17</td></tr><tr><td>رطل متوسط</td><td></td><td></td><td>انظر المرجع 19</td></tr></tbody></table>

في المختبر إعادة تشكيل مجمعات خفيفة حصاد النباتات والطحالب الخضراء

In Vitro Reconstitution of Light-harvesting Complexes of Plants and Green Algae

في النباتات والطحالب الخضراء، وضوء استولت عليها المجمعات حصاد الضوء (LHCs)، وهي عائلة من بروتينات الغشاء لا يتجزأ التي تنسق الكلوروفيل والكاروتينات. في الجسم الحي، يتم طي هذه البروتينات مع المواد الملونة لتشكيل المجمعات التي يتم إدراجها في الغشاء الثايلاكويد للبلاستيدات الخضراء. التشابه عالية في الخصائص الكيميائية والفيزيائية للأعضاء الأسرة، جنبا إلى جنب مع حقيقة أنها يمكن أن يخسر بسهولة أصباغ خلال العزلة، ويجعل تنقية في حالة الأم صعبة. وقد وضعت نهجا بديلا للحصول على الاستعدادات متجانسة من LHCs بواسطة Plumley وشميت في عام 1987 1، الذي أظهر أنه من الممكن لإعادة بناء هذه المجمعات في المختبر بدءا من أصباغ المنقى وapoproteins تكشفت، مما أدى إلى المجمعات مع خصائص مشابهة جدا لتلك التي من مواليد المجمعات. هذا فتح الطريق لاستخدام البكتيرية البروتينات المؤتلف وأعرب عن في المختبر </eم&gt; إعادة. طريقة إعادة قوية لأسباب مختلفة: (1) الاستعدادات نقية من المجمعات الفردية يمكن الحصول عليها، (2) تكوين الصباغ يمكن السيطرة عليها لتقييم مساهمتها في البنية والوظيفة، (3) ويمكن تحور البروتينات المؤتلف لدراسة وظيفية دور مخلفات الفردية (مثل صبغة ملزمة المواقع) أو مجال البروتين (مثل التفاعل البروتين البروتين، قابلة للطي). وقد تم تحسين هذه الطريقة في العديد من المختبرات وتطبيقها على معظم المجمعات حصاد الضوء. بروتوكول الموصوفة هنا تفاصيل طريقة إعادة تشكيل المجمعات ضوء حصاد في المختبر المستخدمة حاليا في المختبر لدينا، ويتم توفير أمثلة تصف تطبيقات الأسلوب.

يوضح هذا البروتوكول تفاصيل إعادة تشكيل مجمعات حصاد الضوء في المختبر. تنسق هذه البروتينات الغشائية المتكاملة الكلوروفيل والكاروتينات وهي مسؤولة عن حصاد الضوء في النباتات العليا والطحالب الخضراء.

In plants and green algae, light is captured by the light-harvesting complexes (LHCs), a family of integral membrane proteins that coordinate chlorophylls ...

الهدف العام من التجربة التالية هو إعادة تكوين مجمعات البروتين الصبغية للنباتات أو الطحالب في المختبر. يتم تحقيق ذلك عن طريق استخراج الأصباغ من أوراق السبانخ أو مزارع الطحالب ، والإفراط في التعبير عن بروتين APA في الكولوني. كخطوة ثانية ، يتم خلط بروتين APA مع الأصباغ للحصول على مركب معاد تكوينه.بعد ذلك ، يتم تنقية مركب البروتين الصباغ المعاد تكوينه من الأصباغ الزائدة ويتم الحصول على نتائج البروتين غير المطوية التي تظهر خصائص طيفية مماثلة لمركب البروتين الصباغ المعاد تشكيله والمركب الأصلي القائم على أطياف الامتصاص ، وأطياف الفلورسنت ، والربوبية الدائرية. الميزة الرئيسية لهذا الإجراء هي أنه يسمح لنا بالحصول على كمية عالية نسبيا من مجمعات البروتين الصباغ ، وكذلك لمعالجة المجمعات المستخدمة في مخاليط البروتين والصبغة من النوع المتحور بتركيبات مختلفة توضح الإجراء سيكون ألبرتو نا ، طالب دراسات عليا في المختبر لبدء إجراء استخراج الصباغ الكلي من أوراق السبانخ. استخدم الخلاط لتجانس حفنة من السبانخ ، ويترك ما يقرب من 20 جراما في 100 مل من مخزن الطحن البارد لمدة 20 ثانية.قم بتصفية المحلول من خلال طبقتين من قماش النايلون بقطر ضعيف يبلغ 20 ميكرومتر وقم بالطرد المركزي للمرشح عند 1 ، 500 Gs لمدة 10 دقائق. عند أربع درجات مئوية. قم بإزالة المادة الطافية وأضف ملليلترا واحدا من محلول الغسيل البارد.أعد تعليق الحبيبات التي تحتوي على البلاستيدات الخضراء بفرشاة رسم فنان ناعمة. بمجرد إعادة تعليق الحبيبات ، أضف 50 مل من الغسيل والمخزن المؤقت والطرد المركزي ، وهو محلول عند 10 ، 000 جم لمدة 10 دقائق. عند أربع درجات مئوية ، قم بإزالة المادة الطافية وأعد تعليق الحبيبات برفق في 50 مل من أجهزة الطرد المركزي العازلة للغسيل ، وهو محلول عند 10 ، 000 Gs لمدة 10 دقائق عند أربع درجات مئوية ، قم بإزالة المادة الطافية تماما من هذه النقطة فصاعدا.يجب تنفيذ هذا الإجراء في الظلام. لتجنب أكسدة الصباغ ، أضف ما يقرب من 20 مل من 80٪ من الأسيتون المغطى بكربونات الصوديوم لاستخراج الأصباغ ، واترك المحلول على الجليد لمدة 10 دقائق. تقوم الدوامة أحيانا بتجميع المكونات الخلوية عن طريق الطرد المركزي عند 12،000 Gs لمدة 15 دقيقة عند أربع درجات مئوية.يجب أن ينتج عن استخراج الصباغ الكلي حبيبات بيضاء. اجمع snat في قمع منفصل. أضف 0.4 مجلدات من داثيل الأثير.رج العبوة بقوة وتأكد من فتح الصمامات لتنفيس الغاز. أضف 0.8 حجم من كلوريد الصوديوم المولي النقطة 33 واخلطه بقوة. اترك حوالي 10 دقائق حتى تنفصل الطبقات.تحتوي مرحلة الأثير في الأعلى على الأصباغ المستخرجة. قم بإزالة المرحلة السفلية الشفافة وتجاهلها. قم بإزالة الأثير عن طريق سكبه من أعلى القمع الفاصل في وعاء زجاجي مناسب.جفف الأثير بإضافة ملعقة من كبريتات الصوديوم الحبيبية اللامائية. قم بتدوير المحلول واترك حوالي خمس دقائق حتى يمتص المجفف الماء من الأثير. عندما يجف الأثير بدرجة كافية.يجب أن يكون هناك بعض البلورات العائمة بحرية وعدم تكتل كبريتات الصوديوم. صب الأثير في وعاء زجاجي جديد ، مع ترك كبريتات الصوديوم صلبة خلف الأصباغ وجففها في فراغ سريع دوار حتى يتبخر الأسيتون تماما. قم بتخزين الأصباغ المجففة على حرارة سالبة 80 درجة مئوية.لا يظهر استخراج الكيراتينويد من السبانخ في هذا الفيديو ، ولكن يتم أيضا تخزين الأصباغ المجففة عند سالب 80 درجة مئوية. تم التعبير عن مجمع الحصاد الخفيف أو LHC لإعادة التكوين وتنقيتها من الإشريكية القولونية في شكل هيئات إدراج. لنجاح إعادة التكوين ، تعتبر النسبة بين البروتينات الصبغية ومقدار استخدام المخزن المؤقت أمرا بالغ الأهمية.يجب تنفيذ هذا الإجراء في ضوء خافت. أعد تعليق 800 ميكروغرام من أجسام تضمين LHC في ما مجموعه 400 ميكرولتر من te. في أنبوب fuge سعة ملليلترين ، أضف 400 ميكرولتر من اثنين من إعادة التكوين والعازلة والدوامة.أضف لفترة وجيزة 0.6 ميكرولتر من مخزون الإيثانول 14.8 مولار بيتا مار كابتا. للحصول على تركيز نهائي يبلغ 10 ملليمولات ، سخني البروتين عند 98 درجة مئوية لمدة دقيقة واحدة. دوامة لفترة وجيزة وضعها في درجة حرارة الغرفة لمدة ثلاث دقائق.أعد تعليق 500 ميكروغرام من إجمالي أصباغ الكلوروفيل المجففة ، بالإضافة إلى 80 ميكروغراما من أصباغ الكيراتينويد في 30 ميكرولتر من الإيثانول بنسبة 100٪ عن طريق الدوامة بقوة. لمدة دقيقة واحدة. قم بتدوير مزيج الصبغة عند 15 ، 800 جم عند أربع درجات مئوية لمدة 30 ثانية تقريبا ، وتأكد من عدم وجود حبيبات مباشرة بعد الدوران ، أضف مزيج الصبغة ببطء إلى البروتين المبرد أثناء الدوامة.احرص على عدم الدوامة بقوة شديدة لأن البروتين يمكن أن يفيض الجزء العلوي من الأنبوب. استمر في الدوامة لمدة خمس إلى 10 ثوان ثم ضع الأنبوب على الجليد الرطب. أضف 94 ميكرولترا من 20٪ أوكتال أو بيتا د جلوسكوسيد أو og للحصول على تركيز نهائي قدره 2٪ دوامة لفترة وجيزة واحتفظ بها على الجليد لمدة 10 دقائق ، أضف 90 ميكرولترا من كلوريد البوتاسيوم المولي للحصول على تركيز نهائي من 150 إلى 200 ضرس صغير.دوامة لفترة وجيزة واحتفظ بها على الجليد لمدة 20 دقيقة. تدور عند 15 ، 800 GS عند أربع درجات مئوية لمدة 10 دقائق. انقل SUP natant إلى أنبوب سعة 10 مليلتر دون إزعاج الحبيبات.حافظ على الناتين باردا ومحميا من الضوء. ابدأ هذا الإجراء بإعداد عمود SROs سعة مليلتر واحد من النيكل كما هو موضح في نص البروتوكول. أضف ثلاثة إلى أربعة ملليلتر من المخزن المؤقت OG إلى عينة البروتين وقم بتحميل العينة على العمود.اشطف العمود بخمسة ملليلتر من المخزن المؤقت OG ، متبوعا بملليلترين من مخزن الشطف OG. قم بتخفيض البروتين المرتبط بثلاثة ملليلتر من محلول elu. اجمع الإيلو الأخضر الذي يحتوي على البروتين المعاد تكوينه.يتم إعداد تدرج السكروز كما هو موضح في نص البروتوكول الذي تمت إزالته بعناية من أعلى التدرج ، وهو نفس حجم الجزء الأخضر المشار إليه من عمود SROs النيكل. قم بتحميل العينة المعاد تكوينها ببطء في الأعلى ، مع الحرص على تجنب إزعاج التدرج. ضع الأنبوب والميزان في دوار دلو متأرجح S SW 41 أو SW 60 وقم بالدوران في جهاز طرد مركزي فائق عند 200،000 Gs عند أربع درجات مئوية لمدة 18 ساعة مع تسارع بطيء وتوقف دون انقطاع.عند اكتمال جهاز الطرد المركزي الفائق ، استخدم الملقط لإخراج التدرج بعناية من حامل الأنبوب. الشريط الأخضر هو جزء يجب جمعه. طيف امتصاص CP 24.تتم مقارنة بروتين ربط الكلوروفيل AB المعاد تكوينه في المختبر مع طيف المركب الأصلي. تشير الأطياف المتطابقة إلى تكوين وتنظيم صبغة متطابقة تقريبا. يمكن أيضا تقييم جودة المركب المعاد تكوينه عن طريق التحليل الطيفي الفلوري.نظرا لأن الأصباغ تنبعث منها مضان عند الإثارة بأطوال موجية مختلفة ، فإن الكلوروفيل أ عند 440 نانومتر الكلوروفيل ب عند 475 نانومتر و zils عند 500 نانومتر. تظهر أطياف انبعاثات التألق لمركب النمط البري CP 24 المعاد تشكيله وتطبيعه إلى الحد الأقصى نقلا فعالا للطاقة من حشوات الكلوروفيل B و XANTHE إلى الكلوروفيل A. يمكن التعرف على وجود الكلوروفيل B غير المنسق مع البروتين من خلال كتف إضافي حوالي 650 نانومتر. بدلا من ذلك ، يؤدي وجود الكلوروفيل الحر A إلى انبعاث إضافي حوالي 675 نانومتر.تظهر أطياف انبعاث الفلورسنت عند 475 نانومتر من كل من مجمعات CP 24 المعاد تشكيلها والأصلية ذروة واحدة عند 681 نانومتر مما يشير إلى أن المركب المعاد تشكيله مطوي بشكل صحيح. يظهر CP 24 المعاد تشكيله والمجمع الأصلي أيضا أطياف كاريزمية دائرية متشابهة جدا. يمكن تغيير بقايا الأحماض الأمينية المفردة المهمة لتنسيق الأصباغ المختلفة لتحليل خصائص الأصباغ الفردية أو تقييم مساهمتها في وظيفة واستقرار المجمع.تظهر هنا أطياف الامتصاص من النوع البري و CP 29 المتحور. يوضح الخط الأخضر الاختلافات بين المخططين عندما تكون هذه التقنية بما في ذلك التدرج SUSE ، يمكن إجراء الطرد المركزي الفائق في غضون 24 ساعة إذا تم إجراؤها بشكل صحيح.

in-vitro-reconstitution-light-harvesting-complexes-plants-green

Research

JoVE Journal

Biology

علم الأحياء

ويهدف النهج وصفها النسبية، كمية البروتين في الحصول على نظرة ثاقبة لتكوين المجمعات multiprotein في ظل ظروف مختلفة، ويتجلى من خلال مقارنة سلالات مختلفة وراثيا. للتحليل الكمي يتم خلط كميات متساوية من كسور مختلفة من التدرج كثافة السكروز وتحليلها بواسطة مطياف الكتلة.

نهج جديد لتحليل مقارن لMultiprotein مجمعات بناء على<sup&gt; 15</sup&gt; N الأيض وصفها والكمية الطيف الكتلي

توضح هذه المخطوطة طريقة بسيطة والإنتاجية العالية لتجميع البروتينات للذوبان في الماء مع أصباغ مسعور التي تقوم على مستحلبات الماء في الزيت. علينا أن نبرهن فعالية الأسلوب في تجميع الكلوروفيل الأم مع أربعة أنواع من المؤتلف للذوبان في الماء، الكلوروفيل ملزم البروتينات (WSCPs) من النباتات الكرنب وأعرب في E. القولونية.

الماء في مستحلب النفط: نظام جديد لتجميع البروتينات ملزم الكلوروفيل المياه القابلة للذوبان مع أصباغ مسعور

هنا نصف إجراء لدراسة الأنسجة النباتية المكسورة بالتجميد. عينات الأوراق المجمدة عالية الضغط مكسورة بالتجميد ومغلفة بطبقة مزدوجة ، مما ينتج عنه عينات مجمدة ورطبة محفوظة جيدا يتم تصويرها باستخدام المجهر الإلكتروني للمسح بالتبريد بتكبير عال مع الحد الأدنى من تلف الحزمة.

دراسة منظمة Supramolecular من الضوئى الأغشية داخل الأنسجة ورقة بكسر تجميد من قبل كرو مسح الميكروسكوب الالكتروني

نقدم هنا، بروتوكولا لعزل فوكوكسانثين الكلوروفيل المكيفات ملزم البروتينات (FCP) من الدياتومات ودمجها في الدهنية مع التراكيب الدهن الطبيعي لدراسة نقل الطاقة الإثارة على تغييرات تكوين أيون.

عزل وإدماج هوائيات حصاد الضوء من دياتوم مينيغينيانا سيكلوتيلا في الدهنية مع الدهون ثايلاكويد

بروتوكول لاستجلاء هذه النباتات ثايلاكويد البروتين منظمة معقدة وتكوينها مع الأزرق polyacrylamide الأصلي هلام التفريد (BN-صفحة) وهو وصف 2D-الحزب الديمقراطي الصربي صفحة. البروتوكول هو الأمثل التمويل نبات، ولكن يمكن استخدامها للأنواع النباتية الأخرى مع تعديلات طفيفة.

تحليل الغشاء ثايلاكويد البروتين المجمعات بالتفريد جل الأصلي الأزرق

نقدم بروتوكولات هنا لعزل عالية الغلة من ثيلاكويدس النشطة فسيولوجيا وفحوصات البروتين النقل بلاستيدات الخضراء التوأم ارجينين إزفاء (كتات)، الافرازية (cpSec1)، وإشارة التعرف على مسارات الجسيمات (كبسرب).

عزل ثيلاكويدس النشطة فسيولوجيا واستخدامها في فحوصات البروتين الطاقة تعتمد على النقل

نقدم هنا بروتوكولا لفصل مجمعات ثايلاكويد solubilized بالتفريد "هلام الأخضر الأصلي". العصابات الخضراء جل تتميز في وقت لاحق بالوقت ارتباطاً وحيد فوتون العد (تكسبك) ويتم توفير الخطوات الأساسية لتحليل البيانات.

الفصل بين "السبانخ ثايلاكويد البروتين المجمعات" بالتفريد هلام الأخضر الأصلي وتوصيف الفرقة استخدام "العد فوتون واحد تيميكوريلاتيد"

يصف هذا البروتوكول التصوير الذاتي خطوة بخطوة وتقييم تغيرات البروتين النباتي في الطحالب الحمراء بناء على التحليل الطيفي. هذه طريقة خالية من الملصقات وغير مدمرة لتقييم التكيف الخلوي مع الموائل المتطرفة ، عندما تتوفر المواد النادرة فقط وتنمو الخلايا ببطء ، أو لا تنمو على الإطلاق ، في ظل ظروف المختبر.

التصوير الذاتي لتقييم فسيولوجيا الطحالب الحمراء

يحدد هذا البروتوكول استخدام التحول بوساطة Agrobacterium tumefaciens-mediation (AMT) لدمج الجينات (الجينات) ذات الأهمية في الجينوم النووي للطحالب الدقيقة الخضراء Chlorella vulgaris ، مما يؤدي إلى إنتاج محولات مستقرة.

Agrobacterium tumefaciens- الهندسة الوراثية بوساطة الطحالب الدقيقة الخضراء ، شلوريلا الشائع

approch قدم واحدة جزيء المجهري رؤى الرواية إلى النقل النووي.

المفرد جزيء التصوير النقل النووية

تعلم إعادة تشكيل مجمعات خفيفة حصاد النباتات والطحالب الخضراء في المختبر باستخدام بروتين APA المعبر عنه في E. coli. تتيح هذه الطريقة تحليل الخصائص الطيفية للمجمعات المعاد تشكيلها.

في المختبر إعادة تشكيل مجمعات خفيفة حصاد النباتات والطحالب الخضراء

استكشف المزيد من الفيديوهات