استخدام الميكروسكيل السيليكون الكابولي لتقييم مقلص الخلوية وظيفة في المختبر

الهدف من التجربة التالية هو قياس النشاط الانقباضي لألياف العضلات المستنبتة استجابة للتحفيز في بيئة مختبرية خاضعة للرقابة. يتم تحقيق ذلك عن طريق طلاء خلايا العضلات المنفصلة على ناتيات السيليكون المجهرية ، والحث على اندماج هذه الخلايا أحادية النواة لتشكيل ألياف تسمى أنابيب myo. ثم يتم نقل هذه الرقائق الكابولية التي تدعم خلايا العضلات المتمايزة إلى مجهر الفيزيولوجيا الكهربية المعدل لدعم الليزر وكاشف الصور المستخدم لقياس انحراف الكابولي استجابة لتقلص العضلات بعد وضع الرقاقة في الحفارة.

يتم وضع الليزر بحيث يركز على طرف الكابولي ويتم محاذاة كاشف الصور أيضا بحيث يلتقط الشعاع المنحرف يتم الحصول على النتائج التي توضح درجة انحراف الكابولي ، والذي ينتج عن تقلص العضلات استجابة للمعالجة الكهربائية أو الكيميائية ، مما يوفر قياسا مباشرا لملف انكماش الخلايا المصنفة في الوقت الفعلي. في النهاية ، يمكن معالجة إزاحة الكابولي لتوفير قراءة للقوة. هذا النظام مضاعف لتوفير سرير اختبار محتمل عالي الإنتاجية لتقييم التغيرات في وظيفة الانقباض استجابة لبروتوكولات العلاج الدوائي أو المرض أو الحالة أو التمرين.

الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالطرق الحالية مثل الفيزيولوجيا الكهربية لمشبك التصحيح ، هي أن طريقة التحليل الوظيفي هذه غير جراحية وقابلة للتكيف بسهولة مع دراسات الإنتاجية العالية. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال تطوير الأدوية ، مثل تحديد تركيزات الاستجابة للجرعة المناسبة قبل التقييم السريري. تمتد الآثار المترتبة على هذه التقنية نحو علاج أمراض العضلات المتعددة لأنها توفر وسائل للتحقيق في الأداء الوظيفي للخلايا من الأنماط الظاهرية المرضية المختلفة في الوقت الفعلي ، على الرغم من ذلك ، يمكن أن توفر هذه الطريقة نظرة ثاقبة لأمراض عضلات الهيكل العظمي.

يمكن استخدامه أيضا لأنظمة الأنسجة الأخرى مثل رقائق الكابولي المعقمة والعضلية المعادية مسبقا و 13 درجة فهرنهايت تنزلق في محلول الإيثانول بنسبة 70٪ والسماح لها بالجفاف في الهواء في غطاء التدفق. ثم ضع رقائق الكابولي الفردية فوق 13 شريحة غطاء فهرنهايت. داخل لوحة قياسية مكونة من 12 بئرا ، قم بتغطية الكابولي بالبوليمر الحيوي أو تعديل السطح المحسن لنوع الخلية المستخدم وفقا لبروتوكولات زراعة الخلايا القياسية ، يستغرق طلاء السطح 30 دقيقة باستخدام طريقة التحضير الخاصة بنا ، ولكن ربما يتم تغييره اعتمادا على بروتوكول الثقافة المحدد للمحقق.

كانت ريس هي الخلايا في وسط نموها المحدد إلى التركيز المطلوب ، ثم مئات الميكرولتر من تعليق الخلية على سطح رقاقة الكابولي ، مما يضمن أن فقاعة الوسيط تغطي نوافذ الكابولي بالكامل. انقل اللوحة التي تحتوي على الرقائق إلى حاضنة واترك الخلايا تلتصق لمدة ساعة على الأقل بعد فترة الطلاء هذه. استخدم ملقطا معقما لنقل الرقاقة إلى بئر نظيف دون انزلاق غطاء 13 درجة فهرنهايت وأضف ملليلترا واحدا من وسط النمو لكل منها.

حسنا ، أعد اللوحة إلى الحاضنة ، وحافظ على الخلايا وفقا لبروتوكولها القياسي للصيانة في المختبر. على زلات الغطاء ، ضع طبق ثقافة ساخن على مسرح مجهر الفيزيولوجيا الكهربية المستقيم. أضف ثلاثة ملليلتر من وسط تغذية الخلية الحالي إلى المجهر الساخن.

أقطاب كهربائية من الفولاذ المقاوم للصدأ مثبتة على المسرح داخل طبق الثقافة الساخن على مسافة فصل 15 ملم. قم بتوصيلها بمولد نبضات قادر على إنتاج التحفيز الميداني والنبضات ذات الشدة والتردد وشكل الموجة المختلفة للسماح للنظام بإنتاج التحفيز الميداني للخلايا عند الاقتضاء. قم بتثبيت ليزر هيليوم نيون مركب على مراحل XY الانتقالية على الجانب السفلي من طاولة المجهر.

ثم اضبط الليزر بحيث يتم توجيه شعاع الليزر عبر قاعدة طبق الثقافة الساخن بزاوية 30 درجة بالنسبة لمستوى الكابولي. الترباس التالي ، وحدة كاشف صور رباعية مثبتة على مراحل XY الانتقالية إلى الجانب السفلي من مرحلة المجهر. اضبط موضعه بحيث يهبط شعاع الليزر المنعكس في وسط الأرباع الأربعة.

اكتب برنامجا للتحكم في المشغلات الخطية التي تقوم بالمسح الضوئي عبر الكابولي بالرجوع إلى مخطط التدفق الموجود في بروتوكول النص. قم بتشغيل أجهزة تحليل الكابولي والبرامج المرتبطة بها. أدخل المرحلة الساخنة في الوسط وانتظر حتى تقرأ 37 درجة مئوية.

بعد ذلك ، أدخل شريحة الكابولي في المسرح مع توجيه الكابولي نحو الجانب الأيمن من المسرح. قم بتشغيل مصدر ضوء المجهر. ركز على المجهر لإبراز حواف الكابولي في الرؤية واستخدم برنامج التحكم في كاشف الصور بالليزر لوضع شعاع الليزر على طرف الكابولي ، بافتراض أن الكابولي موجه إلى يمين ناتئ المسرح.

أحدهما هو الموجود في الجزء العلوي الأيسر من المصفوفة والأرقام تنخفض إلى 16. في أسفل اليسار. الكابولي 17 في الموضع الأيمن العلوي ويمتد إلى 32.

في أسفل اليمين ، اضغط على تشغيل على برنامج التسجيل. ضع كاشف الصور بحيث تقرأ الإشارة صفرا في كل من الإطارين x و y عن طريق ضبط محركات السائر التي تتحكم في كاشف الصور. ثم اضبط الكابولي موضع واحد في برنامج التحكم في كاشف الصور بالليزر.

بعد ذلك ، حرك الليزر إلى طرف الكابولي 16. كرر وضع كاشف الصور واضبط موضع الكابولي 16 في برنامج التحكم في كاشف الصور بالليزر. الآن حرك الليزر إلى طرف الكابولي 32.

كرر وضع كاشف الصور واضبط موضع الكابولي 32 في برنامج التحكم في كاشف الصور بالليزر. أخيرا ، حرك الليزر إلى طرف الكابولي 17. كرر وضع كاشف الصور واضبط موضع الكابولي 17 في برنامج التحكم في كاشف الصور بالليزر.

قم بإيقاف تشغيل مصدر ضوء المجهر ثم الضوء العلوي في المختبر. اضغط على التسجيل على برنامج التسجيل. اضبط جهاز مولد النبض على 40 مللي ثانية وخمس نبضات فولت ، بتردد هرتز واحد.

ثم قم بتشغيل الجهاز باستخدام برنامج التحكم في كاشف الصور بالليزر ، اضبط الجهاز للمسح الضوئي عبر المصفوفة الكابولية 32. التوقف لمدة خمس ثوان في كل ثوان. عند اكتمال فحص 32 ناتئا ، قم بإيقاف تشغيل المحفز.

ثم أوقف برنامج التسجيل وقم بإحضار ملف البيانات. افحص الأثر المسجل من كل ناتئ. للحصول على دليل على نشاط الانقباض.

يعرف الانكماش بأنه ذروة. إذا كان الانحراف على الأقل 0.1 فولت فوق خط الأساس ، فقم بتدوين كل ناتئ مع استجابات إيجابية. قم بإزالة أي ناتئ غير مستجيب من بروتوكول المسح الضوئي على برنامج التحكم في كاشف الصور بالليزر.

يمكن بعد ذلك إعادة مسح الكابول النشط دون تحفيز من أجل الحصول على قراءة لنشاط الانقباض التلقائي للخلية. بعد ذلك ، أضف مركبا علاجيا إلى الوسط لمراقبة تأثيره على الإنتاج الوظيفي للخلايا المستنبتة. بعد إضافة عمليات مسح التشغيل المركبة مع أو بدون التحفيز الكهربائي واسع المجال ، قم بإجراء تقييمات التعب عن طريق تحفيز الخلايا كهربائيا لفترات طويلة ، متبوعا بمسح مستويات الانقباض لقياس المدة التي تستغرقها قوة الذروة لتنخفض إلى ما دون عتبة محددة.

في التجارب التي يتم فيها الحفاظ على الخلايا العصبية الحركية في ثقافة مشتركة مع قياس العضلات لتكوين الوصلات العصبية العضلية من خلال علاج الثقافات المشتركة لأنبوب العضل العضلي العصبي الحركي مع منبه عصبي أو مثبط متشابك والمسح بحثا عن الزيادات والنقصان في النشاط التلقائي ، تابع تحليل بيانات انحراف الكابولي كما هو مفصل في بروتوكول النص. يعد الاستزراع الناجح للخلايا المقلصة على الكابولي إجراء مباشرا نسبيا باستخدام تقنيات زراعة الخلايا القياسية. يمكن استخدام برنامج الفيزيولوجيا الكهربية القياسي لتحليل البيانات الأولية التي تسهل حساب الخصائص الوظيفية ذات الصلة ، مثل وقت قوة الذروة إلى ذروة القوة ، والوقت إلى نصف الاسترخاء.

توفر بروتوكولات التحفيز الموسعة الوسائل لتقييم معدلات التعب في الخلايا المستنبتة ، وبالتالي توسيع مستوى البيانات الفسيولوجية التي يمكن الحصول عليها من هذا النظام. يمكن تعديل نظام زراعة الكابولي ليشمل الخلايا العصبية الحركية في نظام الثقافة باستخدام أنابيب عضلية عضلية للعضلات الهيكلية ، وذلك للسماح بتقييم تكوين المشبك العصبي العضلي في المختبر. في مثل هذه الثقافات ، تتم مقارنة معدلات النشاط الانقباضي التلقائي بمعدلات الانقباض استجابة للعلاج بمنشط خاص بالخلايا العصبية مثل الغلوتامات.

تشير أي زيادات ملحوظة ناتجة عن الغلوتامات في معدلات الانكماش إلى تنشيط الخلايا العصبية المستنبتة مما يؤدي إلى إطلاق الأسيتيل كولين وتنشيط الأنبوب العضلي اللاحق العلاج بمثبطات متشابكة مثل حاصرات مستقبلات الأسيتيل كولين ، dtu rine التي تؤدي إلى توقف النشاط الناجم عن الغلوتامات يوفر مزيدا من الأدلة على وجود نقاط الاشتباك العصبي العضلي الوظيفية في هذه الثقافات. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية استخدام ناتئ السيليكون الدقيق لتقييم الخصائص الوظيفية للعضلات الهيكلية المستنبتة.