مسطحة طوابق منصة رفع الهواء و: طريقة جديدة للجمع بين السلوك مع الميكروسكوب أو الكهربية على استيقظ تتحرك بحرية القوارض
يونيو 29, 2014
هذا الأسلوب يخلق بيئة مألوفة ملموسة للماوس للتنقل واستكشاف أثناء التصوير أو وحيدة الخلية التسجيلات الكهربية المجهرية، التي تتطلب تثبيت الشركة من رأس الحيوان.
مرحبا، أنا هيل لين، طالبة دراسات عليا في مركز العلوم القريبة بجامعة هلسنكي. اليوم سوف نوضح لكم أنا وزملائي كيفية إجراء التسجيلات البصرية والفيزيولوجية الكهربية في إصلاح الرأس المستيقظ ، ولكن بخلاف ذلك تتحرك بحرية وتتصرف. تخلق طريقتنا بيئة ملموسة ومألوفة للماوس للتنقل والاستكشاف.
أثناء التصوير المجهري أو التسجيلات الفيزيولوجية الكهربية أحادية الخلية ، والتي تتطلب تثبيتا ثابتا لرأس ، نقوم بزرع نافذة قحفية مزمنة وتعويد الفأر على قفص منزلي متنقل يتم نقله جوا ، والذي ينزلق تحت أقدام. أثناء الحركة على سطح مستو ، يمكن وضع قفص المنزل المتنقل تحت مجهر عمودي قياسي لتصوير فوتونين أو وضعه في الفيزيولوجيا الكهربية التي تم إعدادها لتسجيلات مشبك التصحيح في دماغ فأر الاستيقاظ. تمت الموافقة على جميع الإجراءات التجريبية المعروضة هنا من قبل لجنة الأخلاقيات المحلية.
نقوم بزرع نوافذ الجمجمة وفقا للبروتوكولات المنشورة مع تعديلات طفيفة عند زرع نافذة الجمجمة. يسمح للحيوان بالتعافي لمدة أسبوعين أو ثلاثة أسابيع على الأقل خلال فترة التعافي هذه ، وعادة ما تستعيد النافذة شفافيتها. يتم استبعاد التي تظهر عليها أي علامات على الالتهاب المتبقي بعد الجراحة من التجارب.
تدريب المختارة للدراسة لتعويدها على تثبيت الرأس. في قفص المنزل المتنقل ، تعامل مع الماوس بهدوء لمدة خمس إلى 10 دقائق ، وتجنب الحركات والضوضاء المفاجئة ، ثم أعده إلى قفص المنزل. كرر الإجراء مرتين أو ثلاث مرات على فترات غير متساوية.
يسمح قفص المنزل المتنقل بتثبيت الرأس دون تخدير قبل تثبيت الرأس. استخدم قطعة قماش للف الماوس مرتين أو ثلاث مرات على فترات غير متساوية. تأكد من بقاء هادئا أثناء لفه.
خلاف ذلك ، كرر الإجراء حتى يعتاد الماوس عليه تماما. ابدأ تدريب الفئران مرتين يوميا على قفص منزلي متنقل في اليوم التالي بعد اكتمال المناولة. قم بوزن قبل كل جلسة تدريبية.
يجب استبعاد التي تظهر فقدان الوزن فوق 10٪ من الدراسة. اضبط موضع ذراع تثبيت الرأس ليتناسب مع حجم المدرب. قم بتوصيل مدخل الهواء لجهاز قفص المنزل المتنقل بمخرج الهواء المضغوط القياسي في المختبر.
تأكد من أن ضغط الهواء كاف للتعويم الحر للقفص المنزلي المنحل جوا. ابدأ تدريب المعتادة في قفص المنزل المتنقل. شل حركة الماوس عن طريق لفه في قطعة قماش.
أدخل الحامل المعدني المتصل برأس في ذراع تثبيت الرأس وثبته بإحكام عن طريق شد البراغي. قم بتشغيل تدفق الهواء لجعل قفص المنزل المنحل جوا يرتفع. قم بإزالة قطعة القماش واسمح للماوس باستكشاف قفص المنزل.
خلال الجلسة التدريبية الأولى ، قد تظهر الفئران سلوكا متجمدا وارتعاشا وانتصاب الذيل. لتعويد على الضوضاء ، وفر تعرضا مستمرا للأصوات المحيطة باستخدام ، على سبيل المثال ، ترجمة إذاعية أو موسيقى وكلام مسجلين أثناء جميع الجلسات التدريبية وكذلك أثناء التجارب. لتجنب الإجهاد المزمن ، استخدم إضاءة الضوء الساطع خلال الساعة الأولى من جلسة التدريب.
بعد الساعة الأولى ، قم بإجراء التدريب في الظلام واستخدم كاميرا الأشعة تحت الحمراء القريبة لمراقبة سلوك. عند اكتمال جلسة التدريب ، حرر من ذراع تثبيت الرأس عن طريق فقدان البراغي. أعد إلى قفص المنزل لمدة ساعتين على الأقل قبل الجلسة التدريبية التالية.
سيؤدي إبقاء الفأر في قفص مع فأرين آخرين أو أكثر إلى تقليل مستوى التوتر. اختياريا ، يمكنك وضع القفص المنقول جوا مع في قفص منزله. سيؤدي ذلك إلى إثراء البيئة وقد يعزز سكن في قفص المنزل المتنقل.
خلال الجلسة التدريبية الأخيرة ، اعتادت الفئران على تثبيت الرأس ويجب أن تظهر سلوكا غير مجهد يتنقل بهدوء حول قفص المنزل الذي تم نقله جوا. في حالة عدم وجود ضوء مرئي ، يمكن تتبع مسار حركة الماوس من خلال مراقبة حركات القفص باستخدام كاميرا الأشعة تحت الحمراء القريبة أو باستخدام ماوس كمبيوتر بصري. أثناء الجلسات التدريبية المطولة التي تستمر لأكثر من ساعة أو ساعتين ، ضع في اعتبارك تزويد الفأر بمياه الشرب ، إما يدويا أو باستخدام حامل ماصة متصل بإطار قفص المنزل المتنقل.
يلخص الرسم البياني التالي الجدول الزمني لدراسة تجريبية نموذجية. تبدأ الدراسة بزرع نافذة الجمجمة قبل أسبوعين من التعامل مع الفأر ، وتستمر بثماني جلسات تدريبية مرتين يوميا. تتضمن الدراسة النموذجية عددا من جلسات التصوير أو جلسات تسجيل مشبك التصحيح المتباعدة على فترات تتراوح من بضع ساعات إلى عدة أيام أو أسابيع.
يمكن إجراء كل من التجارب البصرية والفيزيولوجية الكهربية بالتوازي مع المحفزات والقراءات المعرفية أو السلوكية. الفحص المجهري الفوتوني هو تقنية بصرية غير خطية فريدة تسمح بالتصور في الوقت الفعلي للهياكل الخلوية وحتى تحت الخلوية في الطبقات القشرية العميقة لدماغ القوارض. لإجراء تجربة تصوير مجهري ثنائي الفوتون ، ضع مدربا في قفص المنزل المتنقل ، واضبط السدادات لحماية بصريات المجهر من التلف العرضي.
قم بتنظيف زجاج غطاء نافذة الجمجمة لإزالة جزيئات الغبار. قم بإسقاط سائل الغمر على زجاج الغطاء. نوصي باستخدام محلول اللزوجة لأن الماء يتبخر بسرعة.
يمكن وضع المنصة فوق طاولة بصرية آلية نموذجية باستخدام وضع المجال الواسع للمجهر الفلوري ومرشح انبعاث التمرير الطويل. قم بتقييم الأوعية الدموية في الدماغ وحدد منطقة الاهتمام. لتصوير الأوعية الدموية القشرية حقن في الوريد الذيل لرأس ثابت وثابت ، 70 كيلو دالتون ، تكساس نص مترافق أحمر تران.
يظهر تسلسل الصور هذا تسجيلا بفاصل زمني للأماكن والشرايين في قشرة فأر يتصرف أثناء تنقله حول قفص المنزل المتنقل. من خلال رسم ملف تعريف الخطوط المرسومة عبر تجويف الوعاء ، يمكن للمرء قياس التغيرات في قطر الوعاء وحركة أجزاء الأوعية الفردية. يمكن قياس معدل تدفق الدم في الشرايين والأوردة عن طريق مسح الخط على طول الخطوط المرسومة بالتوازي مع جدار الوعاء الدموي. غرامة.
يمكن تصور تفاصيل مورفولوجيا الخلايا العصبية في الفئران المعدلة وراثيا التي تعبر عن YFP في مجموعة سكانية فرعية من الخلايا العصبية تحت مروج تايوان. يقارن هذان الزاكس استقرار التصوير بين المخدرة والاستيقاظ. تظهر اللوحة الجانبية اليمنى التشعبات من المخدر بخليط الكيتامين زيلازين.
بينما تظهر اللوحة الجانبية اليسرى صورة التشعبات في مستيقظ يتجول في قفص منزل متنقل. يمكن تحليل مورفولوجيا العمود الفقري الفردية في المستيقظة بنفس الموثوقية والدقة كما هو الحال في الفئران المخدرة. لا يتجاوز إزاحة الدماغ أثناء تشغيل عادة من ميكرومتر إلى ميكرومتر ونصف.
تحدث هذه الحركات في الاتجاهات الأفقية ونادرا ما تؤدي إلى تحول في مستوى التصوير مما يجعل تصحيح القطع الأثرية للحركة غير ضروري. في معظم الحالات ، تعد القدرة على مراقبة النشاط العصبي بشكل مزمن في الدماغ الحي المستيقظ ضرورية لفهم تنظيم ووظيفة الجهاز العصبي. باستخدام ربطة عنق واحدة G Camp ثلاثة فئران معدلة وراثيا ، نصور نشاطا عصبيا عفويا في الفئران المستيقظة التي تتصرف في قفص المنزل المتنقل.
يظهر تسلسل صورة الفاصل الزمني هذا أمثلة تمثيلية لارتفاعات الكالسيوم في أجسام الخلايا العصبية والصئبان والمحاور. يسمح التصوير البصري القائم على الإشارات الجوهرية برسم خرائط التوزيع المكاني للمجالات الوظيفية لإجراء تجربة تصوير بصري جوهرية. ضع المدرب في قفص المنزل الموجود أسفل هدف الكاميرا.
نظف زجاج الغطاء من الغبار. ضع قطرة من الجلسرين وقم بتغطيتها بقلة غطاء دائرية بطول خمسة ملليمترات. ضبط موضع الكاميرا عالية السرعة.
ضع مناور بأنبوب نفخ هواء مقابل الاهتزاز المقابل. استخدم الأضواء الخضراء لتصوير خريطة السفينة. ركز بشكل أعمق في القشرة ، حوالي 400 ميكرومتر تحت الأوعية القشرية.
ضع مرشح تمرير النطاق أمام الكاميرا وأضيء القشرة بضوء أحمر. اسمح للماوس بالاعتماد على النظام الأساسي لمدة 30 دقيقة على الأقل. سجل النشاط الأساسي خلال حلقة مدتها ست دقائق.
قم بتحفيز الاهتزاز كل 10 ثوان باستخدام نفث الهواء لمدة ست دقائق. توضح هذه الصورة النشاط العصبي الذي ينتشر على طول القشرة الحسية الجسدية استجابة لتحفيز الاهتزاز بتردد 0.05 هرتز. لإجراء تسجيلات الفيزيولوجيا الكهربية أحادية الخلية ، ضع المدرب المزروع بنافذة قحفية مقلوبة في قفص المنزل المتنقل.
ببطء وحذر ، قم بإزالة زجاج الغطاء من الحامل المعدني. قم بتحديث المخزن المؤقت القشري وتنظيف نافذة الجمجمة من الحطام باستخدام سدادة مرقئ. ضع القطب الأرضي في المخزن المؤقت القشري.
املأ ماصة مشبك التصحيح بمحلول داخل الخلايا. قم بتطبيق ضغط إيجابي على ماصة التسجيل باستخدام مناور دقيق آلي، وقم بتعميق الماصة في القشرة واحصل على اتصال ختم جيجا مع الخلية ذات الاهتمام. بعد التسجيل ، قم بإزالة الماصة ، وقم بتحديث المخزن المؤقت القشري وأغلق نافذة الجمجمة عن طريق الغراء في غطاء زجاجي على الحامل المعدني.
يسمح استخدام قفص منزلي يتم نقله جوا بالجمع بين التصوير والفيزيولوجيا الكهربية مع النماذج السلوكية الكلاسيكية مثل التعلم أو إعادة التأهيل أو السلوك المرتبط بالقلق. حاسة الشم هي مدخلات حسية مهمة للفئران ويمكن استخدامها للتحفيز في اختبارات الذاكرة ، ولتقييم رد الفعل على الحداثة. لإجراء اختبار التعود على الشم ، ضع المدرب في قفص المنزل المتنقل واتركه يتبني.
لمدة 30 دقيقة ، قم بتوصيل قطعة قطن نظيفة مبللة بماء الصنبور بالجدار الداخلي لقفص المنزل المتنقل باستخدام شريط لاصق على الوجهين. بعد خمس دقائق ، استبدل القطن النظيف الموجود على جدار قفص المنزل بقطن جديد مبلل بسائل يحتوي على رائحة الفانيليا. كرر التعرض لمدة خمس دقائق لرائحة الفانيليا ثلاث مرات بفواصل خمس دقائق بين الجلسات.
لقياس مستوى الاهتمام بالرائحة. احسب الوقت التراكمي الذي يقضيه في مواجهة المنطقة المستهدفة والوقت الإجمالي لحركة قفص المنزل المتنقل. خلال الجلسة الخامسة الأخيرة ، قدم رائحة ذات أهمية اجتماعية.
بلل قضيب القطن الجديد ببضع قطرات من البول من الفئران من الجنس الآخر. لتقييم رد الفعل على الجدة ، قسم قفص المنزل المتنقل إلى أربع مناطق. نعلق قطعتين من القطن مقابل بعضهما البعض. لون.
قم بترميزها بعلامات على الجانب الخارجي من جدران قفص المنزل خلال التجربة الأولى. ضع قطعتين قطنيتين نظيفتين. ثم استبدل كلاهما بالقطن المنقوع في مستخلص 1٪ من الفانيليا.
خلال التجربة الثالثة ، ضع قطن الفانيليا في المنطقة الأولى وقطعة القطن المنقوعة في مستخلص موز بنسبة 1٪ في المنطقة. رقم اثنين ، لقياس تفضيل عدم وجود رائحة. احسب الوقت الذي تقضيه في مواجهة عدم وجود رائحة كنسبة مئوية من الوقت التراكمي الذي يواجه المناطق الأخرى.
مرحبا ، أنا ليو كيرو ، باحث رئيسي في مركز العلوم العصبية بجامعة هلسنكي. أتمنى أن تكون قد استمتعت بمشاهدة الفيديو ووجدته مفيدا. لقد عملنا مع twofold على الفحص المجهري في الجسم الحي على مدى السنوات الخمس الماضية ، وكان استخدام الجوانب العامة والجماليات دائما مصدر قلق كبير لأن الجماليات تتداخل مع وظائف المخ وتدفق الدم وكل شيء.
واليوم أنا سعيد لأننا نستطيع العمل على المستيقظة وإجراء تجارب تصوير مجهرية مستقرة والتحقق من صحة النتائج التي حصلنا عليها سابقا في المخدرة. أنا متأكد من أن استخدام قفص المنزل المتنقل والأساليب التي قدمناها اليوم ستزيد من أهمية البحث في الجسم الحي بشكل عام وسيؤدي إلى نتائج جديدة ومتقدمة ، وأنا أتطلع إلى ذلك.
نظرة عامة
تخلق هذه الطريقة بيئة ملموسة ومألوفة للفأر للتنقل والاستكشاف أثناء التصوير المجهري أو تسجيلات الفسيولوجيا الكهربية لخلية واحدة، والتي تتطلب تثبيتًا ثابتًا لرأس الحيوان.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- علم الأعصاب
- الفيزيولوجيا الكهربية
- التصوير المجهري
الخلفية
- تثبيت الرأس ضروري لتصوير دقيق وتسجيلات فيزيولوجية كهربية دقيقة.
- النوافذ القحفية المزمنة تسمح بمراقبة نشاط الدماغ على المدى الطويل.
- التعود على إعداد التجربة ضروري لتقليل التوتر في الحيوانات.
- التصوير المجهري بفوتونين يتيح تصور الهياكل الخلوية في الجسم الحي.
غرض الدراسة
- لتطوير طريقة لإجراء تسجيلات بصرية وفيزيولوجية كهربية في الفئران المستيقظة والمتصرفة.
- لإنشاء بيئة مألوفة تقلل من التوتر أثناء التجارب.
- لتيسير دراسة نشاط الدماغ استجابة للمحفزات السلوكية.
الطرق المستخدمة
- زراعة نافذة قحفية مزمنة.
- استخدام قفص منزل متنقل لتثبيت الرأس.
- تدريب الفئران على التعود على قفص المنزل المتنقل.
- التصوير المجهري بفوتونين وتسجيلات تثبيت الرقعة أثناء السلوك.
النتائج الرئيسية
- نجحت الفئران في التنقل في قفص المنزل المتنقل أثناء التسجيلات.
- تم تحقيق تثبيت الرأس بدون تخدير، مما يسمح بالسلوك الطبيعي.
- وفر التصوير المجهري بفوتونين تصويرًا في الوقت الحقيقي لوعائية الدماغ.
- أظهرت الحيوانات مستويات توتر مخفضة بعد تدريب التعود.
الاستنتاجات
- تتيح هذه الطريقة دراسة وظيفة الدماغ في بيئة أكثر طبيعية.
- تدريب التعود ضروري لتقليل التوتر وتحسين جودة البيانات.
- يمكن أن تعزز تركيبة التصوير والفيزيولوجيا الكهربية فهم الديناميات العصبية.
الأسئلة الشائعة
Executive Industry Relevance
This method enables stable, high-resolution imaging and electrophysiology in awake, behaving rodents, addressing a critical limitation in preclinical neuroscience where anesthetic confounds reduce translational relevance. By combining behavioral paradigms with cellular-level readouts, it supports mechanistic de-risking of therapeutic targets involved in cognition, sensory processing, and neural circuit function. The approach enhances predictive confidence in early discovery by aligning animal model data with naturalistic brain states.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses in neural circuits without anesthetic-induced confounds on neuronal activity or neurovascular coupling.
- Operational Value: Supports functional validation of targets involved in learning, memory, and sensory processing through concurrent behavior and physiology monitoring.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Provides a standardized platform for quantifying neuronal and vascular responses to behavioral stimuli, enabling assay readiness for compound screening.
- Operational Value: Facilitates reproducible, longitudinal measurements of brain function across days or weeks, supporting assay stability and cross-session comparability.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Bridges discovery and preclinical validation by allowing chronic monitoring of neuronal dynamics in disease-relevant behavioral contexts.
- Operational Value: Supports risk-adjusted advancement decisions by reducing biological variability introduced by anesthesia or restraint.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from hypothesis testing through lead identification, enabling iterative refinement of targets based on behaving-animal physiology.
- Discovery Biology: Supports pathway clarification and biological de-risking by linking cellular activity to naturalistic behaviors such as exploration and habituation.
- Screening: Enables quantitative, behavior-linked readouts (e.g., calcium fluxes, vascular dynamics) for evaluating compound effects on neural circuit function.
- Analytics: Generates spatiotemporal maps of neuronal and vascular activity that inform dose-response and target engagement assessments.
- Translational Research: Enhances continuity to preclinical models by preserving ethological relevance in neural readouts.
- Enterprise Reuse: Represents a scalable, platform-compatible capability for repeated use across multiple projects and imaging modalities.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive validity of preclinical data by capturing brain function in awake, behaving states.
- Operational Value: Promotes standardization and reproducibility through habituation protocols and stable head fixation without anesthesia.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision confidence by reducing mechanistic ambiguity in neural target validation.
- Portfolio Impact: Enables risk-aware prioritization of targets based on functional relevance in naturalistic brain circuits.
Implementation Considerations
- Expertise in neurosurgical techniques such as chronic cranial window implantation and head plate attachment.
- Access to two-photon microscopes, electrophysiology rigs, and environmental control systems for airflow and monitoring.
- Standardized training protocols for animal habituation to minimize variability across operators and studies.
- Adaptation considerations for different mouse strains, ages, and behavioral paradigms.
- Practical limitations include the need for prolonged training periods and careful monitoring of animal health and weight during habituation.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:00
Title
1:12
Cranial Window Implantation
1:33
Training
5:35
Applications: Two-photon Microscopy Imaging
8:41
Applications: Intrinsic Optical Imaging
9:59
Applications: Electrophysiology
10:54
Behavioral Experiments
11:08
a) Habituation-dishabituation Olfactory Test
12:17
b) Reaction to Novelty
13:03
Conclusions
