باستخدام تراكب الفحص لقياس نوعيا الإنتاج الجرثومي من والحساسية للالرئوية Bacteriocins
سبتمبر 30, 2014
المنافسة في المكورات العقدية الرئوية بوساطة البكتيريا والببتيدات الصغيرة المضادة للميكروبات ذات النشاط المثبط تجاه المكورات الرئوية والأنواع الأخرى ذات الصلة. نصف هنا مقايسة تراكب بكتيرية محسنة تسمح بتوصيف نشاط البكتيريا والطيف المثبط ، والمناعة الخاصة بالبكتيريا ، والكشف عن ببتيدات استشعار النصاب المفرزة.
الهدف العام من هذا الإجراء هو تصور بكتيريا ونشاط العقدية الالتهاب الرئوي باستخدام مقايسة التراكب. يتم تحقيق ذلك عن طريق طعن سلالة المنتج أولا على لوحة TSA. في الخطوة الثانية ، يتم تحضير خليط سلالة التراكب ثم ماصته ببطء على لوحة TSA التي تحتوي على سلالة المنتج المتدرجة.
في الخطوة الأخيرة ، يتم تقييم النشاط البكتيري. في النهاية ، يمكن استخدام مقايسة التراكب لإظهار عدم نشاط البكتيريا أو إنتاج الفرمون بواسطة السلالة المصابة باهتمام. الميزة الرئيسية لهذه التقنية على الطرق الحالية مثل التنقية المباشرة للبكتيريا ، هي أن هذه الطريقة هي طريقة سريعة لإنشاء مجموعة من البكتيريا وعدم النشاط وفحص سلالات متعددة بحثا عن البكتيريا قيد الإنتاج.
سيتم توضيح الإجراء ناتالي مارشيك ، طالبة دراسات عليا في مختبري لتحضير البكتيريا في المنتج ، ابدأ بخط سلالة المكورات الرئوية ذات الأهمية على لوحة TSA لدم الأغنام بنسبة 5٪ ، واحتضان اللوحة بين عشية وضحاها عند 37 درجة مئوية في 5٪ ثاني أكسيد الكربون. في صباح اليوم التالي ، قم بإخراج 3000 إلى 4,000 وحدة من المحفزات على ألواح تحتوي على 25 مل من TSA ، واستخدم حبات زجاجية معقمة لنشر المحفزات عبر الألواح. بعد ترك الألواح تجف لمدة 10 دقائق تقريبا تحت خزانة السلامة البيولوجية ، اجمع كمية مرئية من البكتيريا على طرف الماصة وطعن طرف الماصة في لوحة TSA المجففة.
إذا أمكن ، قم بتضمين منتج خطيئة البكتيريا المعروف كعنصر تحكم إيجابي والسلالة التي سيتم استخدامها في التراكب كعنصر تحكم سلبي ، مما يوفر مساحة كافية بين الطعنات حتى لا تتداخل هالات النمو. ثم احتضان مزارع الطعن عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة ست ساعات في اليوم السابق لفحص التراكب ، قم بتلقيح خمس إلى 10 مستعمرات من سلالة المكورات الرئوية ليتم اختبارها في أنابيب زجاجية تحتوي على خمسة ملليلتر من وسط THY يحتوي على 0.5٪ مستخلص خميرة. ثم أغلق أغطية مزارع سلالة الجلسرين هذه واحتضانها في حمام مائي 37 درجة مئوية دون اهتزاز.
بعد أربع إلى خمس ساعات ، اقلب الأنابيب برفق عدة مرات ثم قم بقياس القرعة. عندما تصل الثقافات إلى OD اثنين 60 من 0.3 إلى 0.5 ، أضف الجلسرين إلى التركيز النهائي 20٪ ثم قم بتقسيم الثقافات إلى أنابيب طرد مركزي دقيقة سعة 1.5 مليلتر ، وقم بتخزين الأنابيب عند 80 درجة مئوية تحت الصفر. في صباح اليوم التالي ، قم بإذابة كمية من مخزون الجلسرين في درجة حرارة الغرفة.
ثم قبل تطبيق التراكب مباشرة ، امزج خمسة ملليلتر من THY 3000 إلى 4،000 وحدة من المحفز و 200 ميكرولتر من مخزون الجلسرين في أنبوب مخروطي سعة 15 ملليلترا. بالنسبة للسلالات البكتيرية المراسلة ، أضف 50 ميكرولترا من Xcel إلى خليط التراكب باستخدام أنبوب مخروطي واحد لكل لوحة. ضع خليط التراكب في درجة حرارة الغرفة بينما يكون الخليط متوازنا ، قم بإذابة TSA الصلبة في الميكروويف ، ثم ضعه في حمام مائي 55 درجة مئوية.
عندما يبرد TSA المذاب إلى 55 درجة مئوية ، أضف بسرعة ثلاثة ملليلتر من TSA إلى خليط التراكب والماصة لأعلى ولأسفل عدة مرات باستخدام ماصة سعة خمسة ملليلتر. مع الحرص على عدم إدخال الفقاعات ، ثم قم بسحب خليط التراكب ببطء مباشرة على لوحة TSA المكسورة. بعد بضع دقائق عندما تصلب اللوحة وبدون تدوير اللوحة ، ضع ثقافة الطعن المتراكبة بحذر مرة أخرى في الحاضنة للاستزراع بين عشية وضحاها.
في صباح اليوم التالي لاحظ النمو بين عشية وضحاها. يجب أن تظهر الصفائح معتمة من نمو سلالة التراكب ، باستثناء المناطق التي حدثت فيها إشارات التثبيط أو الفرمون. هناك نتيجتان محتملتان لمقايسة التراكب في هذه التجربة التمثيلية.
بعد الاستزراع بين عشية وضحاها ، لوحظت منطقة خلوص تحيط بالسلالة المصابة بالطعن ، مما يشير إلى أن سلالة التراكب هذه حساسة لخطايا البكتيريا التي يتم إنتاجها. لاحظ أيضا دوران السلالة المطعنة في خليط التراكب. في هذه التجربة ، كانت سلالة التراكب محصنة ضد إفراز البكتيريا كما يتضح من عدم وجود هالة تحيط بالطعنة.
من الممكن أيضا أن السلالة المطعون لا تفرز البكتيريا لمقايسة الإشارات. نتيجتان مختلفتان محتملتان. في هذه التجربة ، أفرزت السلالة المطعنة فرمونا تفاعل مع الهيستيدين كيناز سلالة التراكب كما لوحظت المنطقة الزرقاء التي تشير إلى انهيار xal في هذه الصورة.
إذا لم يقم الفرمون بتنشيط نسخ موضع BLP في سلالة المراسل ، أو إذا كانت السلالة المطرقة لا تفرز فرمونا ، فلن يحدث انهيار مقياس X كما هو ملاحظ في هذه الصورة باتباع هذا الإجراء. يمكن إجراء طرق أخرى مثل التحليل الطفري أو التسلسل للإجابة على أسئلة إضافية مثل ما إذا كان أي نشاط مثبط ملموس يعزى إلى موضع BLP أو نقص في النشاط نتيجة لطفرة في جين الناقل.
اعرض النص الكامل واحصل على الوصول إلى آلاف الفيديوهات العلمية
نظرة عامة
تصف هذه المقالة اختبار تغطية بكتيرية مُحسَّن لتصور نشاط بكتيريا Streptococcus pneumoniae. ويسمح هذا الاختبار بتوصيف نشاط البكتيريوسين، والمناعة، والكشف عن ببتيدات استشعار النصاب.
المكونات الرئيسية للدراسة
مجال العلم
- علم الأحياء الدقيقة
- الببتيدات المضادة للميكروبات
- التنافس البكتيري
خلفية علمية
- تتنافس بكتيريا Streptococcus pneumoniae باستخدام الباكتيريوسينات.
- الباكتيريوسينات هي ببتيدات صغيرة مضادة للميكروبات.
- يمكن أن يساهم فهم نشاط الباكتيريوسينات في تطوير استراتيجيات العلاج.
- يلعب استشعار النصاب دوراً في التواصل البكتيري.
الغرض من الدراسة
- لتصوير النشاط البكتيري باستخدام مقايسة التراكب (overlay assay).
- لتقييم نشاط البكتريوسين ونطاق التثبيط.
- للكشف عن ببتيدات استشعار النصاب.
الطرق المستخدمة
- تلقيح السلالة المنتجة عن طريق الوخز على طبق TSA.
- تحضير وتطبيق خليط سلالة الطبقة الفوقية.
- تقييم النشاط البكتيري بعد وضع الطبقة الفوقية.
- مقارنة هذه الطريقة بتقنيات التنقية المباشرة.
النتائج الرئيسية
- يُظهر اختبار التراكب (overlay assay) بشكل فعال عدم نشاط البكتيريا.
- يتيح هذا الاختبار فحص سلالات متعددة بسرعة.
- يوضح إنتاج الفيرومونات بواسطة السلالة المنتجة.
- يوفر بديلاً سريعاً للطرق الحالية.
الاستنتاجات
- يعد مقايسة التراكب المحسنة أداة قيمة لدراسة البكتريوسينات.
- تعزز هذه الطريقة فهم التفاعلات البكتيرية.
- ويمكن أن تسهل إجراء المزيد من الأبحاث حول استراتيجيات مضادات الميكروبات.
الأسئلة الشائعة
الأهمية الصناعية التنفيذية
يتيح اختبار التراكب (overlay assay) الفحص السريع للسلالات البكتيرية للكشف عن إنتاج البكتيريوسين والحساسية تجاهه، مما يدعم التحقق من الأهداف في المراحل المبكرة من اكتشاف مضادات الميكروبات. ومن خلال تصور التفاعلات التنافسية وإشارات استشعار النصاب (quorum sensing)، توفر هذه الطريقة رؤى ميكانيكية حول التنافس البكتيري يمكن أن تساهم في تحديد المركبات الرائدة وتقليل المخاطر المرتبطة بالمرشحات المضادة للميكروبات. ويساعد هذا النهج في تحديد أولويات السلالات أو المسارات ذات الإمكانات العلاجية قبل الاستثمار في عمليات التنقية أو التوصيف التي تستهلك موارد كثيفة.
التطبيقات الاستراتيجية في البحث والتطوير في مجال الأدوية الحيوية
الاكتشاف المبكر والتحقق من الهدف
- القيمة العلمية: استقصاء الفرضيات العلاجية من خلال ربط إنتاج البكتيريوسين باللياقة التنافسية في البيئات متعددة الميكروبات.
- القيمة التشغيلية: تمكين التحقق الوظيفي من موقع blp كمحدد للتضاد البكتيري دون الحاجة إلى تنقية الببتيد.
- القيمة التنبؤية: دعم فرز المحفظة من خلال تحديد السلالات ذات الإفراز النشط للبكتيريوسين لإجراء مزيد من تقليل المخاطر الميكانيكية.
الفحص وتطوير المقايسة
- القيمة العلمية: يجهز أنظمة بيولوجية تم التحقق من صحتها لعمليات الفحص المضاد للميكروبات اللاحقة من خلال تأكيد نشاط الباكتريوسين وملفات المناعة.
- القيمة التشغيلية: يوحد القراءات النوعية (مناطق التثبيط، وإشارات المراسل المستحثة بالفيرومونات) عبر سلالات متعددة لإجراء تحليل مقارن قابل للتكرار.
- قيمة القابلية للتوسع: يسهل التقييم عالي الإنتاجية لمكتبات السلالات، مما يسمح بالتحديد السريع للمنتجين والمؤشرات الحساسة لتحسين المقايسة.
الأبحاث الانتقالية والما قبل سريرية
- القيمة الانتقالية: يربط نشاط الباكتيريوسين في مرحلة الاكتشاف بالأهمية قبل السريرية من خلال توصيف أطياف التثبيط النوعية للسلالة وآليات التهرب المناعي.
- تقليل المخاطر الميكانيكية: يوضح ما إذا كان التثبيط الملحوظ يعود إلى موقع blp، مما يقلل من النتائج الإيجابية الكاذبة في التحقق من فعالية المركبات المضادة للميكروبات.
- مواءمة المؤشرات الحيوية: يكشف عن ببتيدات استشعار النصاب المفرزة التي قد تعمل كمؤشرات حيوية انتقالية لتنشيط المسار في البيئات الأصلية.
تكامل مسار العمل وسير العمل
يندرج تحليل التراكب (overlay assay) ضمن مرحلة الاستكشاف المبكر، حيث يدعم اختبار الفرضيات في عملية التحقق من الهدف، ويمكّن من جاهزية التحليل لسير عمل تحديد المركبات الرائدة التي تركز على الببتيدات المضادة للميكروبات.
- بيولوجيا الاكتشاف: اختبار الفرضيات المتعلقة بآليات التنافس البكتيري من خلال تصوير التثبيط بوساطة البكتريوسين وأنماط الحساسية الخاصة بالسلالات.
- الفحص: إنتاج قراءات نشاط نوعية تساهم في توحيد المقايسات وقابلية تكرارها لحملات الفحص التي تستهدف المنتجين للبكتريوسين.
- التحليلات: توفير مخرجات قابلة للقياس مثل تكوين منطقة التثبيط وتنشيط الجين المراسل (على سبيل المثال، تحلل lacZ) لمقارنة الظروف وتتبع تعديل المسار.
- البحث الانتقالي: ربط الملاحظات المختبرية لإفراز البكتريوسين بالأهمية المحتملة داخل الجسم الحي من خلال تقييم وظيفة موضع blp في العزلات السريرية أو البيئية.
- إعادة الاستخدام المؤسسي: إنشاء منصة فحص قابلة لإعادة الاستخدام لتقييم نشاط البكتريوسين عبر مجموعات متنوعة من السلالات، مما يقلل من التطوير المتكرر للطرق.
التأثير التشغيلي والمؤسسي
- القيمة العلمية: تزيد من الثقة التنبؤية في التحقق من الهدف عن طريق تقليل الغموض الميكانيكي حول المنافسة التي تتوسطها البكتريوسينات.
- القيمة التشغيلية: تعزز إمكانية التكرار والتوحيد القياسي لتقييمات النشاط النوعي للمضادات الميكروبية عبر المختبرات المختلفة.
- القيمة الاستراتيجية: تحسن قرارات المضي قدماً أو التوقف في البرامج الأولية للمضادات الميكروبية من خلال التحديد السريع للسلالات المنتجة التي تعطي نتائج سلبية كاذبة أو السلالات المقاومة.
- التأثير على المحفظة: تتيح تحديد الأولويات للسلالات أو المواقع الجينية بناءً على تعديل المخاطر، وذلك وفقاً لملفات الحساسية ووظائف البكتريوسينات المثبتة.
اعتبارات التنفيذ
- يتطلب خبرة في التعامل مع البكتيريا اللاهوائية وتقنيات التغطية المعقمة لمنع التلوث وضمان التفسير الدقيق لنطاق التثبيط.
- يعتمد على توفر أطباق TSA، ووسط THY، وسلالات lacZ-reporter، وبيئات حضانة محكومة (37°C, 5% CO2).
- يستلزم توحيد عمق الغرس، وحجم الطبقة المغطية، وفترات الحضانة لضمان الحصول على نتائج تثبيط أو إشارات قابلة للتكرار بين المستخدمين.
- يجب مراعاة التباين في حركية نمو السلالات وتوقيت إفراز الفيرومونات عند تكييف المقايسة مع خلفيات جينية أو أنواع جديدة.
- يقتصر على المخرجات النوعية أو شبه الكمية؛ وتبرز الحاجة إلى طرق تكميلية (مثل الطفرات الموجهة، أو التسلسل الجيني) لتأكيد الاعتماد على موقع blp أو وظيفة الناقل.
