إعداد متشابك غشاء البلازما والبروتينات الكثافة بعد المشبكي باستخدام التدرج السكروز متقطع

الهدف العام من هذا الإجراء هو إظهار التجزئة الخلوية لأنسجة المخ باستخدام تدرج سكروز متقطع لإثراء البروتينات من الأغشية المشبكية وكثافة ما بعد التشابك. يتم تحقيق ذلك عن طريق تجانس أنسجة المخ أولا باستخدام الخالط الكهربائي. فيما يلي سلسلة من خطوات الطرد المركزي لتحضير مستخلصات بروتين الغشاء الخام.

ثم يتم وضع مستخلصات الغشاء على تدرج سكروز متقطع للطرد المركزي الفائق. الخطوة الأخيرة هي جمع البروتينات من التدرج. في النهاية ، يمكن أن تظهر النتائج تغيرات في مستويات البروتين المشبكي من خلال تحليل اللطخة الغربية.

هذه تقنية راسخة استخدمها علماء الأعصاب لأكثر من 40 عاما. نستخدمه في مختبرنا لفهم كيفية تغير تكوين البروتين في المشبك عندما نعتزج أنظمة الناقل العصبي المختلفة. الميزة الرئيسية لهذه التقنية على الطرق الأخرى ، مثل تدرجات المكالمة أو تدرجات السكروز المستمرة ، هي أن تدرجات السكروز المتقطعة أسهل في البناء يدويا.

يستخدم هذا البروتوكول الخالط الزجاجي الذي يعمل بمحرك ، ودائما ما يحل محل المدقة بين العينات ويشطف ويجفف. الخالط أولا ، قم بتحميل الأنسجة المقطعة في أنبوب سعة 13 مليلتر مع أربعة ملليلتر من محلول السكروز المخزن HEPA 0.32 مولار. ثم انقل الأنسجة إلى الخالط الزجاجي النظيف.

اضبط المحرك على 900 دورة في الدقيقة وقم بتجانس العينة ب 12 ضربة على مدى 30 ثانية باستخدام أقل من أربعة جرامات من الأنسجة ، ويضمن التجزئة الجيدة ، ونقل العينة مرة أخرى إلى الأنبوب وتخزين 100 ميكرولتر عند سالب 80 درجة مئوية لتحليل البروتين. بعد ذلك ، افصل المادة النووية عن طريق تدوير المتجانس عند 900 جم لمدة 10 دقائق. عند أربع درجات مئوية ، انقل المادة الطافية إلى أنبوب جديد سعة 15 مل.

يحتوي المادة الطافية على جزء الغشاء الخام. الآن لإثراء جهاز الطرد المركزي المشبكي الخام ، المادة الطافية عند 10 ، 000 جم لمدة 15 دقيقة عند أربع درجات مئوية ، قم بإزالة المادة الطافية. تحتوي الحبيبات على جزء المشبكي الخام Resus.

علقه في مليلتر واحد من محلول السكروز المولي 0.32. ثم عند ثلاثة ملليلتر أخرى من محلول جهاز الطرد المركزي المعلق ، الجزء الخام لمدة 15 دقيقة عند 10 ، 000 جم عند أربع درجات مئوية ، قم بإزالة المادة الطافية. الآن قمل الحبيبات بسرعة ، وأعد تعليق الحبيبات في مليلتر من الماء النقي.

ثم أضف ثلاثة ملليلتر أخرى من الماء بسرعة. انقل هذا إلى الخالط. ضع ثلاث ضربات يدويا وانقلها مرة أخرى إلى أنبوب 13 ملليلترا.

اضبط العينة بسرعة مرة أخرى إلى أربعة مللي مولار HEAs مع إضافة 16 ميكرولترا من HEAs مولاري واحد واخلطها عن طريق الانعكاس. الآن ضع العينة على دوار عند أربع درجات مئوية لمدة نصف ساعة. لضمان تحلل العينة ، قم بإنهاء التجزئة عن طريق تكوير الكسر الأولي ل Lysed P.

قم بتدويرها عند 25 ، 000 جم لمدة 20 دقيقة عند أربع درجات مئوية ، وقم بإزالة المادة الطافية ، وأعد تعليق الحبيبات في مليلتر من محلول السكروز. يحتوي هذا على الأغشية العرضية المخصبة المشبك. أولا ، قم بقياس المخازن المؤقتة مسبقا لعمل تدرج سكروز متقطع.

قم بتحميل ثلاثة أنابيب على النحو التالي ، أحدها يحتوي على 3.5 مل بالضبط من محلول السكروز المخزن 1.2 مولار. آخر يحتوي على ثلاثة ملليلتر بالضبط من محلول 1.0 مولي ، والثالث بثلاثة ملليلتر من محلول 0.8 مولي. بعد ذلك ، باستخدام ماصة زجاجية ، انقل محلول السكروز 1.2 مولار إلى أنبوب طرد مركزي فائق بوليمر سعة 12 ملليلترا.

باستخدام ماصة جديدة، ضع المحلول 1.0 المولي بحذر على محلول 1.2 مولي. لا تزعج المحلول 1.2 المولي أو تدخل فقاعات مع الماصة. استخدم نفس التقنية لوضع محلول 0.8 مولي في الأعلى.

توخي الحذر. الاهتزازات الصغيرة من دوامة مقاعد البدلاء أو أجهزة الطرد المركزي الدقيقة كافية لإزعاج سلامة التدرج. من المهم بناء التدرجات بعناية وكفاءة.

إذا استغرق الأمر وقتا طويلا أو إذا تعرض التدرج للاهتزاز ، فلن تتمكن من استعادة الأغشية المشبكية في الخطوات اللاحقة. الآن مع طبقة ماصة القس الأخرى ، الجزء الغشائي العرضي المخصب المخصب أعلى التدرج المعد. قم بموازنة التدرج بدقة في جهاز طرد مركزي فائق في دوار دلو متأرجح.

ثم قم بتدويرها عند 150،000 جم لمدة ساعتين عند أربع درجات مئوية. كن حذرا جدا عند إزالة التدرج من الجرافة بعد الطرد المركزي ، يجب أن تكون هناك شرائط واضحة من محلول السكروز. مع وجود كسور البروتين في كل واجهة وحبيبات ، لا ينبغي أن تكون الكسور منتشرة.

باستخدام إبرة قياس 18 وحقنة سعة مليلتر واحد ، قم بثقب الجزء السفلي من الواجهة إلى 1.2 مولار واسحب الشريط الأبيض من البروتين ، الذي يحتوي على أغشية البلازما المتشابكة. سجل حجم هذه الطبقة. انقل الطبقة إلى أنبوب طرد مركزي فائق الجدران بسمك 3.5 ملليلتر.

أضف 2.5 مجلدا بالضبط من أربعة مللي مولار. ثم قم بإعداد أنبوب موازن بمحلول سكروز مخزن 0.32 مولار HEAs في دوار بزاوية ثابتة ، وقم بعمل طرد مركزي فائق للعينة عند 200 ، 000 جم لمدة 30 دقيقة عند أربع درجات مئوية. ثم تخلص من السنا وأعد تعليق حبيبات غشاء البلازما المتشابك.

في 300 ميكرولتر من 50 ملليمولار HEAs محلول EDTA مللي مول. يمكن الآن جمع جزء كثافة ما بعد التشابك أو جزء PSD عن طريق الاستخدام الإضافي لنفس التقنيات. تم تحديد الخطوات بوضوح في بروتوكول النص.

تم تشغيل لطخة غربية ببروتين كلي ، وغشاء البلازما المشبكي ، وأول كسور بروتين ذات كثافة ما بعد التشابك. خضع جزء PSD لعلاج منظف واحد فقط ، وكان النسيج من مخطط الفأر. يتم إثراء البروتينات قبل المشبكية مثل ناقل الدوبامين في جزء SPM ، ولكن يتم التخلص منها في خطوة المنظفات اللاحقة لتخصيب PSD.

أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر الاحتفاظ بجميع العينات على الجليد وتضمين مثبطات البروتياز والفوسفاتيز باتباع هذا الإجراء. يمكن إجراء طرق أخرى مثل تحليل الدم الغربي أو الرحلان الكهربائي للهلام ثنائي الأبعاد. ثم يمكنك الإجابة على أسئلة مثل كيفية تأثير العلاج الدوائي على مستويات المستقبلات في المشبك العصبي.