التصوير في الوقت الحقيقي من محور عصبي نقل الكم دوت المسمى عامل التغذية العصبية في الخلايا العصبية الابتدائية

الهدف العام من هذا الإجراء هو تتبع النقل المحوري الرجعي لعامل التغذية العصبية المشتق من الدماغ أو BDNF عن طريق التصوير الحي. يتم تحقيق ذلك عن طريق تجميع غرف الموائع الدقيقة أولا على زلات غطاء مطلية بالبولي لايسين. في الخطوة الثانية ، يتم تشريح الخلايا العصبية في الحصين E 18 المنفصلة وطلاءها في حجرة جسم الخلية في غرفة الموائع الدقيقة.

بعد ذلك ، يتم زراعة الخلايا العصبية للسماح بتمديد المحاور عبر الأخاديد الدقيقة إلى الحجرة المحورية للغرفة. في الخطوة الأخيرة ، تتم إضافة النقطة الكمومية المسماة BDNF إلى حجرة المحور العصبي. في النهاية ، يمكن استخدام الفحص المجهري الفلوري لتقييم حركة BDNF داخل محاور الخلايا العصبية في الحصين.

الميزة الرئيسية لهذه التقنية على الطرق الحالية مثل B-D-F-E-G-I-P أو BDFM هي أن وضع العلامات على BDF بالنقطة الكمومية يسمح بالتصوير الضوئي لثنائيات BDF واحدة داخل المحاور التي توضح أن الإجراء سيكون ، يجب أن يكون. ارسم نقطة عمودية من الثلاثة اليسرى ، ابدأ بغسل غرف الموائع الدقيقة يدويا في 1٪ aox ، متبوعا بثلاث عمليات شطف لمدة 30 دقيقة في ماء مللي Q. ثم بعد غسل الغرف يدويا في 70٪ من الإيثانول ، ضعها لتجف على البارام في غطاء تدفق رقائقي ، وقم بتعقيم جانبي الغرف تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية لمدة 20 دقيقة ، ثم قم بتخزين الغرف المشعة في طبق معقم بطول 15 سم مختوم بمعلمة في درجة حرارة الغرفة.

بعد ذلك ، نقع 24 × 40 ملم. ينزلق الغطاء الزجاجي رقم واحد في 10٪ من حمض الهيدروكلوريك طوال الليل على دوار متبوعا بثلاث غسلات لمدة 30 دقيقة بالماء بعد الغسيل الأخير. قم بتعقيم كل زلة غطاء مع غمس في 100٪ من الإيثانول ، متبوعا بإشعال النار فوق موقد بنسن وتخزينها جافة في طبق بتري معقم في درجة حرارة الغرفة.

لتغطية زلات الغطاء ، ضعها في طبق استزراع 15 سم ثم ضع طبقة من كل منها 0.7 مل من 0.01٪ بولي ليسين. بعد حضانة لمدة ساعة واحدة في غطاء مزرعة الأنسجة ، اشطف الغطاء ثلاث مرات مرة أخرى بالماء المعقم ثم جففه بالمكنسة الكهربائية وضعه في طبق ثقافة يبلغ طوله ستة سنتيمترات. ثم ضع إحدى الغرف المعقمة بحيث يكون جانب الأخدود الصغير متجها لأسفل على زلة غطاء مطلية ب بولي L.

مع الحرص على عدم لمس الأخاديد الدقيقة واستخدام طرف ماصة صغيرة للضغط برفق على الغرفة وإغلاق حجرة الموائع الدقيقة المجمعة بإحكام. الآن ضع اثنين من E 17 إلى E 18 فرس النهر كامبي في أنبوب مخروطي سعة 15 مليلتر يحتوي على ملليلترين من محلول التشريح وشطف الأنسجة ثلاث مرات بخمسة ملليلتر من المخزن المؤقت للتشريح في كل مرة. ثم قم بإزالة أكبر قدر ممكن من الغسيل وأضف 900 ميكرولتر من محلول التشريح الطازج لهضم الأنسجة.

بعد ذلك ، أضف 100 ميكرولتر من 2.5٪ تريبسين إلى الأنسجة وضع الأنبوب في حمام مائي 37 درجة مئوية. بعد 10 دقائق من الهضم ، أضف 100 ميكرولتر من الحمض النووي واحد واستخدم ماصة زجاجية من البولي إيثيلين المصقولة بالنار لتصنيف الأنسجة برفق لأعلى ولأسفل من خمس إلى 10 مرات مباشرة بعد الخلط. قم بإخماد التجربة بملليلترين من وسط الطلاء واترك الحطام يستقر في قاع الأنبوب لمدة خمس دقائق في غطاء زراعة الأنسجة.

بعد ذلك ، انقل ملليلترين من المادة الطافية بعناية إلى أنبوب مخروطي معقم ونظيف سعة 15 مليلتر وقم بتدوير الخلايا العصيية. قم بتعليق الحبيبات في 50 ميكرولتر من وسائط الطلاء ، ثم بعد العد ، قم بتحميل 15 إلى 20 ميكرولترا من تعليق الخلية في حجرة واحدة من غرفة الموائع الدقيقة. احتضن الغرفة لمدة 10 دقائق للسماح للخلايا بالالتصاق بقلة الغطاء ، ثم أضف المزيد من وسائط الطلاء لملء كلا الجزأين من الغرفة.

بعد يوم واحد من الحضانة ، استبدل وسائط الطلاء بوسائط الصيانة في كل من جسم الخلية ومقصورات المحور العصبي. في اليوم الثالث ، تبدأ المحاور من الخلايا العصبية في الحصين في عبور الأخاديد الدقيقة التي تصل إلى حجرة المحور العصبي بين اليومين الخامس والسابع. خلال هذا الوقت ، استبدل نصف وسائط الاستزراع بوسائط صيانة جديدة كل 24 إلى 48 ساعة قبل التصوير المباشر للنقل المحوري BDNF المسمى الكمي.

اشطف كلا الجزأين من حجرة الموائع الدقيقة جيدا باستخدام الوسائط القاعدية العصبية الخالية من المصل الخالي من BDNF كل 30 دقيقة لمدة ساعتين أثناء استنفاد BDNF ، واحتضن 50 نانو مولار أحادي ثنائي BDNF مع 50 نانو مولار كوانتوم مولار. قم بعمل 6 5 5 مترافقات شريطة في الوسائط القاعدية العصبية على الجليد لمدة 60 دقيقة. ثم استبدل الوسائط الموجودة في حجرة المحور العصبي ب 300 ميكرولتر من النقاط الكمومية المسماة BDNF لمدة أربع ساعات عند 37 درجة مئوية لتقليل انتشار النقطة الكمومية المسماة BDNF في حجرة جسم الخلية.

من المهم جدا الحفاظ دائما على مستوى أعلى من الوسائط في حجرة جسم الخلية مقارنة بالحجرة المحورية في نهاية الحضانة والإحماء والمجهر المقلوب ، والمجهزة بهدف زيت 100 × وغرفة بيئية إلى درجة حرارة ثابتة تبلغ 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون أثناء تسخين المعدات. اغسل النقطة الكمومية غير المنضمة المسماة BDNF من غرفة الموائع الدقيقة ، ثم استخدم مجموعة من مكعبات الإثارة والانبعاث الحمراء في تكساس لتصور إشارة النقطة الكمومية 6 5 5. أخيرا ، استخدم كاميرا CCD لالتقاط صور بفاصل زمني داخل المحاور الوسطى بسرعة إطار واحد في الثانية لمدة دقيقتين.

استخدم الأخاديد الدقيقة التي لا تحتوي على محاور عصبية ليس لها QD كعنصر تحكم في التسلل وتحليل نقل BDNF باستخدام برنامج تحليل الصور المناسب في التصوير بفاصل زمني لنقل إشارة BDNF المسماة BDNF لوحظت إشارات النقاط الكمومية في معظم الأخاديد الدقيقة ذات المحاور العصبية ، بينما لا تظهر أي إشارة كمومية في الأخاديد الدقيقة بدون محاور تشير إلى انتشار ضئيل أو معدوم لإشارة النقطة الكمومية من حجرة المحور العصبي إلى حجرة جسم الخلية هنا. تم تسجيل جزء بطول 80 ميكرومترا من محور عصبي الحصين بالفلورسنت لمدة 100 ثانية. ما مجموعه ستة.

لوحظت إشارات BDNF الكمومية بوضوح أثناء التصوير مع ملاحظة ثلاثة تتحرك أحادية الاتجاه نحو جسم الخلية. لوحظ أن إشارة واحدة تتحرك بسلاسة إلى جسم الخلية تعبر الحقل بأكمله في حوالي 70 ثانية. لوحظ أن آخر يتحرك في اتجاه رجعي لأول 20 ثانية ، وتحول إلى حركة طعام لمدة 10 إلى 20 ثانية ، ثم يغير اتجاهه مرة أخرى نحو جسم الخلية خلال آخر 20 ثانية.

لوحظ أيضا أن الحدث الثالث يتحرك في اتجاه رجعي ، ولكن بعد ذلك يتوقف لمدة 20 ثانية تقريبا أثناء منتصف الحركة. في هذا الرسم البياني التمثيلي الأول للنقطة الكمومية المسمى BDNF النقل ، تحركت النقطة الكمومية المسماة BDNF بسرعة وسلاسة نحو جسم الخلية التي تعبر مجال 80 ميكرومتر في حوالي 60 ثانية. مع فترات توقف قصيرة جدا في هذا الكرونوغراف الثاني ، سافر BDNF الكمي حوالي 50 ميكرومتر في 120 ثانية في اتجاه رجعي مع ثلاثة أجزاء على الأقل من فترات التوقف الأطول.

أخيرا ، تقيس مخططات التشتت السرعة المتحركة ومتوسط السرعة ووقت التوقف المؤقت لكل نقطة كمومية واحدة تسمى BDNF. كانت السرعات المتحركة للنقطة الكمومية المسماة BDNF سريعة نسبيا ، تتراوح من 0.47 إلى 1.97 ميكرومتر في الثانية بمتوسط 1.06 زائد أو ناقص 0.05 ميكرومتر في الثانية. بسبب توقف BDNF أثناء النقل ، كان متوسط السرعة أقل بكثير من السرعة المتحركة بمتوسط 0.48 زائد أو ناقص 0.03 ميكرومتر في الثانية بمتوسط مدة توقف 15.88 زائد أو ناقص 1.30 ثانية بعد التطور.

تسمح هذه التقنية للباحثين في مجال علم الأعصاب باستكشاف هرمون التغذية العصبية والمستقبلات في الخلايا العصبية السليمة والمرضية.