قياسات الوقت الحقيقي من البروتين غشاء: مستقبلات التفاعلات عن طريق مأكل السطح الرنين (SPR)

الهدف العام من التجربة التالية هو إظهار تفاعل مستقبلات البروتين باستخدام البلازما السطحية والرنين. يتم تحقيق ذلك عن طريق حقن أيونات النيكل فوق حمض الخليك الثلاثي أو NT مصفوفة. بعد ذلك ، يتم تثبيت أحد البروتينات المسماة الترابط على شريحة المستشعر بعد الحقن الفارغ.

يتم حقن البروتين الثاني المسمى المادة التحليلية فوق الترابط الثابت من أجل اكتشاف التفاعل بين البروتينين ، تظهر النتائج أن البروتينين يتفاعلان بشكل عابر مع الرابطين التحليليين ، وينفصلان عن الترابط. يمكن حساب تقارب التفاعل بناء على معدلات التفكك والتفكك المقاسة للبروتينين.

الميزة الرئيسية لهذه التقنية على الطرق الحالية مثل السحب أو الترسيب المناعي ، هي أنها يمكن أن تحدد تفاعل التقارب العابر أو المنخفض الذي غالبا ما يكون له عواقب بيولوجية كبيرة. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في الكيمياء الحيوية مثل ما إذا كان البروتين محل الاهتمام يرتبط ببروتين آخر أو جزيء صغير آخر ، يمكن تحديد طبيعة التفاعل ويمكن قياس التقارب. لتحضير العينة ، قم بإزالة جميع الركام من البروتين المنقى كما هو موضح في بروتوكول النص.

قم بإعداد المخزن المؤقت قيد التشغيل وتصفية جميع المخازن المؤقتة وعينات البروتين باستخدام مرشحات نقطة صفر 22 ميكرون. تأكد من أن المرشحات متوافقة مع البروتين مسبقا قبل توصيل الزجاجة العازلة قيد التشغيل بمدخل المضخة. احتفظ جانبا ب 10 مل من المخزن المؤقت الجاري في أنبوب منفصل.

ثم قم بتخفيف العينات مقابل المخزن المؤقت قيد التشغيل لتجنب عدم تطابق المخزن المؤقت. كقاعدة عامة ، من أجل تسريح الترابط المستقر ، استخدم تركيزات منخفضة من الترابط مع حقن أطول عند تدفق منخفض بدلا من تركيزات الترابط العالية مع الحقن الأقصر عند التدفق العالي ، قم بتخفيف مخزون الترابط المركز في مخزن مؤقت قيد التشغيل إلى تركيز نهائي يبلغ حوالي 20 ميكروغراما لكل ملليلتر. أخيرا ، قم بتخفيف المادة التحليلية في المخزن المؤقت الجاري إلى التركيز المطلوب.

بالنسبة لنظام غير معروف التقارب ، اختبر مجموعة من تركيزات التحليل من 10 ميكرومولار إلى 10 مولر في تخفيفات عشرة أضعاف. في هذا العرض التوضيحي ، يتم إعادة استخدام شريحة مقترنة NTA مناسبة لالتقاط البروتينات بعلامة oli histidin. بعد أخذ الشريحة المخزنة من المخزن المؤقت ، اشطفها جيدا بالماء المقطر المزدوج ، وجففها برفق ، وضعها في غمدها الأصلي.

لتثبيت الشريحة على أداة SPR ، افتح باب شريحة المستشعر وضع الشريحة في غلافها. أغلق الباب واضغط على شريحة قفص الاتهام. اضبط درجة حرارة خلية الرقاقة على 25 درجة مئوية.

اضبط حجرة العينات على سبع درجات مئوية للحفاظ على استقرار البروتين طوال التجربة. بعد إعداد حلول التحميل والتجريد كما هو موضح في بروتوكول النص ، قم بتجهيز أداة SPR بمخزن مؤقت قيد التشغيل. للخطوة التالية ، اضبط التدفق على 50 ميكرولتر في الدقيقة.

حدد مسارات التدفق والطرح المرجعي للحصول على النتائج الموضحة هنا. اضبط المسارات على خلية التدفق رقم واحد وخلية التدفق رقم اثنين وخلية التدفق رقم واحد ، مطروحة من خلية التدفق رقم اثنين ، بعد تحديد حامل العينة المناسب ، احفظ ملف النتائج قبل بدء التجربة بحيث يتم حفظ البيانات أثناء التشغيل. تتكون كل تجربة من دورات.

احتفظ بسجل واضح للحقن التي تتم في كل دورة وافصل الروابط التي تحمل الحقن الفارغ للمخزن المؤقت وحقن التحليل إلى دورات مختلفة. الدورة الأولى هي تحضير الرقائق وتحميل النيكل. تأكد من ضبط التدفق والمسارات ثم قم بحقن 350 مللي مولار EDTA لمدة دقيقة واحدة لغسل الجزيئات المتبقية.

بعد ذلك ، اضبط التدفق على 10 ميكرولتر في الدقيقة. ثم حقن 0.5 مللي مولار كلوريد النيكل لمدة دقيقتين. الآن راتنج الرقاقة مغطى بأيونات النيكل.

الدورة الثانية هي تثبيت الترابط. اضبط التدفق على 15 ميكرولتر في الدقيقة واضبط مسار التدفق على خلية التدفق. رقم اثنين ، قم بحقن الترابط A حتى تصل إلى وحدة الاستجابة أو قيم R ru التي تتراوح من 10 إلى 20 ضعف الوزن الجزيئي للترابط.

على سبيل المثال ، قم بتحميل رابط من 50 كيلودلتون إلى ما بين 501 ، 000 روس. احتفظ بسجل لقيمة RU التي تم تحقيقها. ثم اضبط التدفق على 15 ميكرولتر في الدقيقة ومسار التدفق لتدفق الخلية رقم واحد ، وحقن ترابط التحكم B حتى نفس قيمة RU مثل تلك الخاصة بالترابط ، ومراقبة الطرح ، sensori Graham عبر الإنترنت للمساعدة في التحكم في طول الحقن.

بعد ذلك ، اضبط التدفق على 50 ميكرولتر في الدقيقة ومسار التدفق لخلية التدفق رقم واحد وخلية التدفق. رقم اثنين ، استمر في غسل النظام لمدة خمس إلى 20 دقيقة حتى يستقر خط الأساس. الدورة الثالثة هي الحقن الفارغ.

هذا الحقن سوف يعمل على الطرح الفارغ. لذلك قم بتضمين جميع المكونات التي سيتم حقنها بالمادة التحليلية باستثناء المادة التحليلية نفسها. يمكن أن يختلف طول الحقن اعتمادا على الوقت الذي يستغرقه الوصول إلى التوازن.

اضبط التدفق على 15 ميكرولتر في الدقيقة واضبط مسار التدفق على خلية التدفق رقم واحد وخلية التدفق رقم اثنين ، وخلية التدفق رقم واحد ، مطروحة من خلية التدفق. ثانيا ، أدخل أمر الوزن لمدة 30 ثانية لتحقيق خط أساس مستقر. ثم قم بحقن المخزن المؤقت قيد التشغيل لمدة 13 ثانية.

انتظر من 120 إلى 600 ثانية لتسجيل مرحلة التفكك. يختلف طول هذه الخطوة حسب دينار كويتي. كلما كان التفكك أبطأ ، كلما طالت مدة هذه الخطوة.

الدورة الرابعة هي حقن التحليل. انسخ والصق الشروط الدقيقة المستخدمة في الدورة الثالثة بحيث يمكن طرح هاتين الحقنتين لاحقا. قم بتغيير موقع الفتحة في الحامل من الفتحة التي تحمل محلول التحكم إلى تلك التي تحتوي على محلول التحليل التحليلي.

اختر تركيزا أعلى قليلا من ثابت تفكك التوازن المتوقع. إذا لم تكن هناك معرفة مسبقة متوفرة ، فاختر ميكرومولار واحدا كنقطة انطلاق جيدة. بعد إجراء الحقن العازلة وحقن التحليل مرة ثانية ، قم بإجراء دورة الرقائق السابعة.

اضبط التدفق على 50 ميكرولتر في الدقيقة ، ثم قم بحقن 350 ملي EDTA مولار لمدة دقيقة واحدة. كرر هذه الخطوة مرتين أخريين. لا تستخدم حقنة واحدة لمدة ثلاث دقائق لأن ذلك قد يؤدي إلى تلف الشريحة.

بعد ذلك ، قم بحقن 0.25٪ كبريتات DCAL الصوديوم لمدة دقيقة واحدة. كرر هذه الخطوة مرتين. لا تستخدم حقنة واحدة مدتها ثلاث دقائق لأن ذلك قد يؤدي إلى إتلاف الرقاقة بعد تحميل النيكل ، يتم تثبيت الناقل محل الاهتمام على خلية التدفق رقم اثنين حتى 3 ، 500 R rus.

ثم باستخدام نفس مدة التدفق والحقن ، يتم حقن رابط التحكم في خلية التدفق رقم واحد ، ويصل في البداية إلى 3000 R فقط للتأكد من تثبيت كميات البروتين المتشابهة على كلتا خليتي التدفق. يتم تحميل رابط التحكم أيضا بحقن أقصر أثناء مراقبة التحميل حتى 3،500 RDUs. يمثل شكل الدرج الزيادة التدريجية في الكتلة في خلية التدفق رقم واحد عند كل حقن موضح هنا هو خلية التدفق رقم واحد ، مطروحة من خلية التدفق.

ثانيا ، من المهم تغيير مدة حقن الروابط لتحقيق تحميل متساو. في المقابل ، يجب أن تظل مدة حقن المادة المراد تحليلها ثابتة لجميع التركيزات المستخدمة للحصول على بيانات كمية. يتم حقن مجموعة من تركيزات المواد التحليلية.

تظهر هنا حقن بتركيزات تحليلية مختلفة بطول حقن ثابت. يتم حقن تركيزات التحليل المختلفة بترتيب عشوائي وتكون الجرام الحسي الفارغ المزدوج محاذاة للمحور x قبل التحليل لاشتقاق التقارب وثابت المعدل. يتم تطبيق تركيب النموذج.

ثابت تفكك التوازن المحسوب لتفاعل BCA mod هو حوالي ثلاثة أضعاف 10 أس سالب ستة مولر مع KA سريع إلى حد ما وسريع KD بمجرد إتقانه. يمكن إجراء هذه التقنية في غضون ساعات قليلة بعد مشاهدة هذا الفيديو. يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تصميم وإجراء تجربة SPR باستخدام البروتين الذي تهمك.