RNA تسلسل تحليل التفاضلية التعبير الجيني في Electroporated الفرخ الجنينية الحبل الشوكي
نوفمبر 1, 2014
يوضح هذا الفيديو الخطوات الأساسية لإجراء تحليل النسخ الكامل على عينات الحبل الشوكي الجنيني للكتكوت المقطعة بعد التعدي باستخدام التثقيب الكهربائي في البيضا.
الهدف العام من هذا الإجراء هو تقييم مستويات التعبير لجميع الجينات والعينات من الحبل الشوكي الجنيني للكتكوت الكهربائي. يتم تحقيق ذلك عن طريق أولا في البيض ، وحفر الجانب الأيمن من الأنابيب العصبية الجنينية المبكرة وإعادة احتضان الأجنة إلى المرحلة المرغوبة. تتمثل الخطوة الثانية من الإجراء في تشريح أنصاف الأنبوب العصبي المنقولة بنجاح في بيئة خالية من الحمض النووي الريبي والمضي قدما في التحلل في أسرع وقت ممكن.
الخطوة الثالثة هي عزل الحمض النووي الريبي وإخضاع العينات لإعداد المكتبة وتسلسل عالي الإنتاجية. الخطوة الأخيرة هي معالجة مجموعات البيانات لإزالة البيانات الاصطناعية للتسلسل. قم بتعيين السلالات إلى الجينوم وتعيين مستويات التعبير لكل جين.
في النهاية ، يمكن أن تظهر النتائج جينات معبر عنها تفاضليا من خلال مقارنة مستويات التعبير في ظروف التحكم والتجربة. يعد العرض المرئي لهذه الطريقة أمرا بالغ الأهمية كتشريح للأنبوب العصبي. يصعب تعلم الخطوات لأننا نحتاج إلى الإلمام بالتلاعب بالأجنة.
في هذا العرض التوضيحي ، تم تحويل الأجنة باستخدام GFP الذي يعبر عن البناء في الأنبوب العصبي. استعد لقضاء ساعتين في العمل على ما يصل إلى 10 أجنة لجمع ميكروغرام إلى ميكروغرام من إجمالي الحمض النووي الريبي لكل جنين. في ظل الحمض النووي الريبي ، والظروف الحرة ، حصاد الأجنة باستخدام مقص تشريح ناعم وملعقة تجميع SVE لنقل كل جنين إلى البرد.
عولج DEPC. استخدم PBS حلا لجميع خطوات عزل الأنبوب العصبي باستخدام ملاقط دقيقة لإزالة منطقة الجناح بأكملها للجنين بين براعم الأطراف. انقل هذا القسم إلى محلول بارد طازج مع وضع الجانب الظهري للأنسجة لأعلى.
استخدم إبرتين زجاجيتين رفيعتين لثقب ثلاث بقع على كل جانب جانبي ظهري من الجنين بين الأنبوب العصبي والأديم المتوسط الجانبي. أدخل الآن الإبرتين الزجاجيتين في الثقب المركزي وحركهما بعيدا عن بعضهما البعض على طول محور AP. افعل ذلك من خلال كل ثقب حسب الحاجة لفصل الأديم المتوسط البارالي في النهاية ، وإزالة هذا النسيج والتخلص منه.
بعد ذلك ، اقلب الجنين جانبا وأدخل أطراف ملاقطين بين الأنبوب العصبي والحبل العقدي. حركها بعيدا على طول محور AP لتقسيم الهياكل. قم بإنهاء إزالة القطع الكبيرة من الأنسجة الوسيطة من الأنبوب العصبي عن طريق تثبيتها برفق بالملاقط أثناء إزالة الأديم المتوسط الزائد.
ثم انقل الأنبوب العصبي برفق إلى محلول بارد طازج. باستخدام ماصة زجاجية مزودة بمضخة يدوية ، اجمع كل الأنابيب العصبية المطلوبة واحتفظ بها على الجليد قبل المتابعة. الآن ، قسم كل أنبوب من الأنابيب العصبية إلى نصفين.
أدخل ملاقط ذات طرف حاد في التجويف وقم بتمزيق لوحة السقف. ثم استخدم الملقط لقطع صفيحة الأرضية وتقسيم الأنسجة إلى نصفين. باستخدام مجهر تشريح الفلورسنت ، قم بفرز الأنبوب الكهربائي من النصفين غير الكهربائيين.
انقل أنصاف الأنبوب العصبي المصنف إلى أنبوب سعة 1.5 مل بمحلول جديد. انقر فوق هذه الأنابيب لتوصيل كل الأنسجة إلى الأسفل. بعد ذلك ، قم بتدوير الأنابيب عند 100 GS لبضع ثوان.
ثم بعناية فائقة تحت الإضاءة الساطعة ، استنشق snat. إذا تم سحب الأنسجة ، فقم بإخراجها ببطء وكرر الدوران. بمجرد إزالة نصفي الأنبوب العصبي من المحلول ، أضف 70 ميكرولترا لكل أنبوب عصبي ، ونصف المخزن المؤقت للتحلل إلى الأنبوب.
قمبتحريك الأنبوب واحتضانه في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة كل خمس دقائق ، وقم بتدوير الأنبوب بقوة واستمر في جمع الحمض النووي الريبي لتنقية الحمض النووي الريبي للتسلسل ، احصل على ثمانية أنصاف أنبوب عصبي على الأقل لكل عينة. يمكن تجميع مجموعات أخرى من الأنابيب العصبية المخزنة عند سالب 80 درجة مئوية في المجموعة. ابدأ بإذابتها على الجليد لمدة 15 إلى 30 دقيقة ، ثم أكمل الذوبان في درجة حرارة الغرفة.
بمجرد إذابة الجليد ، قم بدوامة جميع العينات بقوة واتركها لمدة خمس دقائق. ثم قم بتدوير العينات مرة أخرى وقم بطردها عند 15 ، 000 GS لمدة دقيقة واحدة. للتخلص من المواد غير القابلة للذوبان ، انقل المادة الطافية إلى أنبوب جديد واستمر في الاستخراج.
باستخدام مجموعة عزل الحمض النووي الريبي ، أكمل العملية عن طريق التهرب من الحمض النووي الريبي بأكبر تركيز ممكن. يتطلب هذا البروتوكول حساب موقع Galaxy على الويب لضمان حصة المساحة المطلوبة. أولا ، يقوم FTP بتحميل ملفات FASTQ إلى الموقع ما لم تكن درجات الجودة مشفرة بالفعل في Shred plus 33.
أولا ، قم بإعداد مجموعات البيانات التي تم تحميلها باستخدام أداة FASTQ groomer ضمن قائمة NGS QC و Manipulation. وإلا، ضمن السمات، قم بتغيير نوع الملف إلى مرسل FASTQ. بعد ذلك ، ضمن قائمة NGS QC و Manipulation ، استخدم أداة FAST QC لتحليل الجودة العامة لمجموعات البيانات.
حدد أداة تشذيب الجودة FASTQ ضمن نفس القائمة للتخلص من الأطراف الرئيسية الثلاثة ذات الجودة المنخفضة. يجب معالجة درجة الجودة 20 أو أعلى. انتقل الآن إلى أداة القصاصة ضمن نفس القائمة.
قم بتعيين هذه الأداة لتجاهل القراءات التي تحتوي على أقل من 45 زوجا أساسيا. أدخل تسلسل المحول. قم بتعطيل خيار تجاهل القراءات ذات القواعد غير المعروفة، واختر الإخراج لتضمين التسلسلات المقطوعة وغير المقطوعة.
تابع باستخدام أداة تسلسلات القطع. استخدمه لقص القواعد الأولى للقراءة لإزالة انحياز التسلسل الأساسي الخمسة الذي تم اكتشافه بواسطة FAST qc. الخطوة التالية هي تنزيل أحدث مجموعة جينوم الدجاج وفكها من موقع جينوم Illumina I.
ثم قم بتحميل ملف تنسيق الجينوم بالكامل بشكل أسرع وملف تنسيق GTF للتعليق التوضيحي للجين إلى Galaxy History. الآن قم بتعيين القراءات لكل عينة إلى الجينوم من خلال الوصول إلى قائمة تحليل N-G-S-R-N-A وتحديد أداة القبعة العلوية. حدد ملف fasta الذي تم تحميله من تاريخ Galaxy كجينوم مرجعي.
بعد ذلك ، اختر أداة روابط الأكمام ضمن نفس القائمة لإنشاء نسخة متوقعة. لكل عينة، اختر ملف GTF لاستخدامه كدليل مرجعي للتعليقات التوضيحية. حدد إجراء تصحيح التحيز باستخدام ملف FASTA لبيانات التسلسل وقم بتمكين خيار استخدام تصحيح القراءة المتعددة.
ثم ادمج جميع نسخ التجميع باستخدام أداة دمج الكفة. باستخدام هذه الأداة ، اختر ملف GTF للتعليق التوضيحي المرجعي وملف FASTA لبيانات التسلسل. قارن الآن ملفات BAM التي تم إنشاؤها بواسطة أعلى قبعة اثنين لكل عينة باستخدام أداة الكفة TIFF التي لا تزال ضمن قائمة تحليل الحمض النووي الريبي.
في حقل النصوص ، حدد نسخ الدمج الذي تم إنشاؤه بواسطة دمج الكفة وقم بتمكين الخيارات. استخدم القراءة المتعددة بشكل صحيح وقم بتصحيح التحيز باستخدام ملف FASTA لبيانات التسلسل. الخطوة التالية هي فرز الجداول التفاضلية باستخدام عمود قيمة Q ، حدد أداة الفرز من قائمة التصفية والفرز.
سيكون للتسلسلات ذات الاختلاف المعتد به بين الظروف التجريبية أدنى قيم Q في العمود 13. الآن ألق نظرة على الرسوم البيانية للتغطية. أولا ، قم بتحويل ملفات BAM إلى ملفات رسم بياني للسرير باستخدام أداة التحويل ضمن قائمة أدوات السرير ضمن الخيارات ، وقم بتعطيل الإبلاغ عن المناطق التي لا تحتوي على تغطية واختر التعامل مع الإدخالات المقسمة على أنها فترات زمنية مميزة.
قم أيضا بتوسيع نطاق التغطية بعامل يعمل على تطبيع جميع التغطيات في التجربة. ثم قم بتحويل ملف الرسم البياني للسرير الناتج إلى تنسيق شعر مستعار كبير باستخدام الأداة الموجودة في قائمة تنسيقات التحويل وقم بتحميل ملف شعر مستعار كبير كمسار مخصص إلى خادم UCSE. في صفحة متصفح الجينوم USCS ، استخدم GAL أربعة تجميع وعمليات بحث جينية للتغطية المرئية لمجموعات البيانات باستخدام الطرق الموصوفة التي تم حصاد الأنابيب العصبية التي تعبر عن نواقل PS الفارغة من أجل الحمض النووي الريبي الخاص بها.
تم ذلك في نسختين وكان الحمض النووي الريبي الناتج بجودة عالية جدا مع قيمة RIN مثالية تبلغ 10 كما هو متوقع. أظهرت المقارنة العالمية لنسخ عناصر التحكم في المتجهات الفارغة المكررة عدم وجود فرق واضح وكان معامل ارتباط بيرسون هو النقطة 99. أيضا ، كانت هناك زيادة واضحة في عدد القراءات المعينة لتسلسل الجينات في عينة تجريبية تعبر عن منطقة إصبع الزنك للخدش.
وبالتالي ، كانت الطرق حساسة بما يكفي للكشف عن التخصيب المتوقع. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن تكون قادرا على عزل الأنبوب العصبي الجنيني والحصول على فهم جيد لكيفية معالجة ومقارنة مجموعة بيانات IC للعثور على الجينات المعبر عنها تفاضليا باتباع خطوات تحليل السيليكون في القسم الرابع من البروتوكول.
اعرض النص الكامل واحصل على الوصول إلى آلاف الفيديوهات العلمية
نظرة عامة
يُظهر هذا الفيديو إجراء تحليل النسخ الكامل لعينات الحبل الشوكي الجنيني للدجاج بعد التوصيل الكهربائي داخل الكيس المحوري. تهدف الطريقة إلى تقييم مستويات التعبير الجيني في الحبال الشوكية التي تم توصيلها كهربائيًا.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- علم الأعصاب
- التعبير الجيني
- علم الأحياء التنموي
الخلفية
- توفر تحليل النسخ الكامل نظرة ثاقبة للتعبير الجيني.
- التوصيل الكهربائي داخل الكيس المحوري هو تقنية تُستخدم لنقل الأنسجة الجنينية.
- تعمل أجنة الدجاج كنموذج لدراسة تطور الحبل الشوكي.
- عزل الرنا مهم لتحليل النسخ الدقيق.
هدف الدراسة
- لتقييم مستويات التعبير لجميع الجينات في الحبل الشوكي الجنيني للدجاج.
- لتقييم فعالية التوصيل الكهربائي داخل الكيس المحوري لتوصيل الجينات.
- لتوفير بروتوكول للباحثين المهتمين بعلم النسخ.
الطرق المستخدمة
- التوصيل الكهربائي داخل الكيس المحوري لجنين الدجاج.
- تشريح نصفي الأنبوب العصبي في بيئة خالية من الرنا.
- عزل الرنا وإعداد المكتبة.
- التسلسل عالي الإنتاجية ومعالجة البيانات.
النتائج الرئيسية
- العزل الناجح للرنا من الحبال الشوكية التي تم توصيلها كهربائيًا.
- بيانات تسلسل عالية الجودة تم الحصول عليها من العينات.
- مستويات التعبير لمختلف الجينات التي تم رسمها على الجينوم.
- تحديد وتصحيح القطع الأثرية للتسلسل.
الاستنتاجات
- يقوم البروتوكول بتقييم فعال للتعبير الجيني في الحبل الشوكي للدجاج.
- التوصيل الكهربائي داخل الكيس المحوري طريقة قابلة للتطبيق لتوصيل الجينات.
- توفر هذه الدراسة أساسًا للبحوث النسخية المستقبلية.
الأسئلة المتداولة
Executive Industry Relevance
This method enables target validation in early neuroscience discovery by linking genetic manipulation to transcriptome-wide functional readouts. It supports mechanistic de-risking of neural factor hypotheses through quantitative differential expression analysis. The approach provides predictive confidence for prioritizing targets in spinal cord development pathways before committing to lead identification efforts.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by measuring genome-wide transcriptional responses to electroporated constructs in embryonic spinal cord.
- Operational Value: Uses chick embryo model to functionally validate neural targets in a disease-relevant system with high transcriptional fidelity.
- Predictive Value: Enables detection of differentially expressed genes to clarify pathway involvement and de-risk target mechanisms prior to assay development.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates high-quality RNA-seq data suitable for establishing baseline transcriptomes in control and experimental conditions.
- Operational Value: Produces reproducible gene expression measurements that support assay standardization for downstream screening campaigns.
- Scalability Value: Leverages public Galaxy server for bioinformatic processing, eliminating need for local computational infrastructure in small-to-medium scale target validation studies.
Translational & Preclinical Research
- Translational Value: Connects early discovery findings to preclinical continuity by identifying differentially expressed genes relevant to spinal cord development pathways.
- Mechanistic De-risking: Confirms construct overexpression (e.g., scratch two zinc finger domains) through transcriptomic enrichment, supporting target engagement validation.
- Predictive Confidence: Uses replicate control samples with Pearson correlation of 0.99 to ensure detection sensitivity for true differential expression in experimental conditions.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target hypothesis testing through lead identification by providing transcriptome-scale functional readouts that inform target selection and prioritization.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by comparing transcriptomes of control and experimental spinal cord halves following electroporation.
- Screening: Enables assay readiness through standardized RNA isolation and library preparation under RNase-free conditions, yielding sequencing-ready samples.
- Analytics: Delivers quantitative gene expression measurements via RNA-seq, allowing comparison of expression levels and identification of significantly differentially expressed transcripts using Q-value thresholds.
- Translational Research: Connects early target validation to preclinical relevance by identifying differentially expressed genes in neural development pathways with visual verification of construct overexpression.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable transcriptome analysis workflow for neural target validation that can be applied across multiple constructs and developmental stages.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Provides predictive confidence in target validation through genome-wide expression profiling and reduction of mechanistic ambiguity in neural development models.
- Operational Value: Ensures standardization and reproducibility via RNase-free dissection, high-quality RNA isolation (RIN 10), and public server-based bioinformatic processing.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by enabling early detection of transcriptional responses, reducing late-stage biological risk in neuroscience target programs.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted target prioritization by delivering quantitative differential expression data that informs advancement decisions in lead identification.
Implementation Considerations
- Requires expertise in embryo manipulation, in ovo electroporation, and RNase-free tissue handling for successful neural tube dissection.
- Depends on access to high-throughput sequencing and public bioinformatic platforms (Galaxy) for RNA-seq data processing and differential expression analysis.
- Necessitates standardization across teams for embryo staging (HH23), dissection consistency, and library preparation to ensure reproducible transcriptome comparisons.
- Involves adaptation considerations when applying the method to different embryonic stages, constructs, or model systems beyond chick spinal cord.
- Practical limitations include the technical difficulty of neural tube dissection and the requirement for biological replicates to achieve sufficient statistical power for differential expression detection.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:22
Harvesting Neural Tubes for RNA Collection
4:32
Pooling Tissue to Purify RNA for Illumina Sequencing
5:34
Comparing RNA-Seq Datasets on the Galaxy Public Server
9:52
Transcriptome Analysis Quality
9:52
Results: Transcriptome Analyis Quality
10:42
Conclusion
