Name: نشر Homalodisca coagulata فيروس-01 عبر Homalodisca vitripennis الثقافة خلية (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-09-25T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 52 s
Description: اكتشف بروتوكولًا لاستنساخ فيروس HoCV-1 في خلايا Homalodisca vitripennis واستخراج الحمض النووي الريبوزي لتقييم التكاثر الفيروسي. تساعد هذه الطريقة الباحثين على دراسة ديناميكيات الفيروسات وتفاعلاتها مع المضيف.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

نود أن نشكر برنامج أبحاث وتعليم الأمراض في تكساس بيرس ووزارة الزراعة الأمريكية-APHIS على دعمهم التمويلي لهذا المشروع. نود أيضا أن نشكر هيما كوثاري في مركز العلوم الصحية بجامعة تكساس في تايلر على مساعدتها في الفحص المجهري متحد البؤر.

<ol><li>Takiya, D. M., McKamey, S. H., Cavichioli, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Validity+of+Homalodisca+and+of+H.+vitripennis+as+the+Name+for+Glassy-winged+Sharpshooter+%28Hemiptera%3A+Cicadellidae%3A+Cicadellinae%29%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Entomol.+Soc.+Am%22%5BJournal%5D)">Validity of Homalodisca and of H. vitripennis as the Name for Glassy-winged Sharpshooter (Hemiptera: Cicadellidae: Cicadellinae).</a> Ann. Entomol. Soc. Am. 99 (4), 648-655 (2006).</li>
<li>Hunter, W. B., Katsar, C. S., Chaparro, J. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+analysis+of+capsid+protein+of+Homalodisca+coagulata+Virus-1%2C+a+new+leafhopper-infecting+virus+from+the+glassy-winged+sharpshooter%2C+Homalodisca+coagulata%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Insect+Sci%22%5BJournal%5D)">Molecular analysis of capsid protein of Homalodisca coagulata Virus-1, a new leafhopper-infecting virus from the glassy-winged sharpshooter, Homalodisca coagulata.</a> J. Insect Sci. 6 (28), 1-10 (2006).</li>
<li>Hunnicutt, L. E., Hunter, W. B., Cave, R. D., Powell, C. A., Mozoruk, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+sequence+and+molecular+characterization+of+Homalodisca+coagulata+virus-1%2C+a+novel+virus+discovered+in+the+glassy-winged+sharpshooter+%28Hemiptera%3A+Cicadellidae%29%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Genome sequence and molecular characterization of Homalodisca coagulata virus-1, a novel virus discovered in the glassy-winged sharpshooter (Hemiptera: Cicadellidae).</a> Virology. 350 (1), 67-78 (2006).</li>
<li>Hunnicutt, L. E., Mozoruk, J., Hunter, W. B., Crosslin, J. M., Cave, R. D., Powell, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prevalence+and+natural+host+range+of+Homalodisca+coagulata+virus-1+%28HoCV-1%29%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Prevalence and natural host range of Homalodisca coagulata virus-1 (HoCV-1).</a> Virology. 153, 61-67 (2008).</li>
<li>Jones, W. A., Setamou, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biology+and+Biometry+of+Sharpshooter+Homalodisca+coagulata+%28Homoptera%29+Cicadellidae%29+Reared+on+Cowpea%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Entomol.+Soc.+Am%22%5BJournal%5D)">Biology and Biometry of Sharpshooter Homalodisca coagulata (Homoptera) Cicadellidae) Reared on Cowpea.</a> Ann. Entomol. Soc. Am. 98 (3), 322-328 (2005).</li>
<li>Turner, W. F., Pollard, H. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Life+histories+and+behavior+of+five+insect+vectors+of+phony+peach+disease%5BTitle%5D)+AND+%22US+Dep.+Agric.+Tech.+Bull%22%5BJournal%5D)">Life histories and behavior of five insect vectors of phony peach disease.</a> US Dep. Agric. Tech. Bull. 1188, 1-32 (1959).</li>
<li>Brodbeck, B. V., Andersen, P. C., Mizell, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Utilization+of+primary+nutrients+by+the+polyphagous+xylophage%2C+Homalodisca+coagulata%2C+reared+on+single+host+species%5BTitle%5D)+AND+%22Arch.+Insect+Biochem.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Utilization of primary nutrients by the polyphagous xylophage, Homalodisca coagulata, reared on single host species.</a> Arch. Insect Biochem. Physiol. 32, 65-83 (1996).</li>
<li>Brodbeck, B. V., Andersen, P. C., Mizell, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+total+dietary+nitrogen+and+nitrogen+form+on+the+development+of+xylophagous+leafhoppers%5BTitle%5D)+AND+%22Arch.+Insect+Biochem.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Effects of total dietary nitrogen and nitrogen form on the development of xylophagous leafhoppers.</a> Arch. Insect Biochem. Physiol. 42, 37-50 (1999).</li>
<li>Kamita, S. G., Do, Z. N., Samra, A. I., Halger, J. R., Hammock, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+Cell+Lines+Developed+from+the+Glassy-winged+Sharpshooter%2C+Homalodisca+coagulata+%28Hemiptera%3A+Cicadellidae%29%5BTitle%5D)+AND+%22In+vitro+Cell+Dev.-An%22%5BJournal%5D)">Characterization of Cell Lines Developed from the Glassy-winged Sharpshooter, Homalodisca coagulata (Hemiptera: Cicadellidae).</a> In vitro Cell Dev.-An. 41, 149-153 (2005).</li>
<li>Hunter, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Medium+for+development+of+bee+cell+cultures+%28Apis+mellifera%3A+Hymenoptera%3A+Apidae%29%5BTitle%5D)+AND+%22In+vitro+Cell+Dev.-An%22%5BJournal%5D)">Medium for development of bee cell cultures (Apis mellifera: Hymenoptera: Apidae).</a> In vitro Cell Dev.-An. 46 (2), 83-86 (2010).</li>
<li>Identification and whole extraction of Homalodisca coagulata-virus01. (HoCV-01) from Texas glassy-winged sharpshooter populations. Bextine, B., Hunter, W., Marshall, P., Hail, D. CA Pierce’s Disease Symposium, Sacramento, CA, , 9-12 (2009).</li>
<li>Rhoades, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Economics+of+baculovirus+%E2%80%93+insect+cell+production%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotechnology%22%5BJournal%5D)">Economics of baculovirus – insect cell production.</a> Cytotechnology. 20, 291-297 (1996).</li>
<li>Briske-Anderson, M. J., Finley, J. W., Newman, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+influence+of+culture+time+and+passage+number+on+the+morphological+and+physiological+development+of+Caco-2+cells%5BTitle%5D)+AND+%22P.+Soc.+Exp.+Biol.+Med%22%5BJournal%5D)">The influence of culture time and passage number on the morphological and physiological development of Caco-2 cells.</a> P. Soc. Exp. Biol. Med. 214 (3), 248-257 (1997).</li>
<li>Chin, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deficiency+Rescues+the+Adverse+Effects+of+Telomere+Loss+and+Cooperates+with+Telomere+Dysfunction+to+Accelerate+Carcinogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Deficiency Rescues the Adverse Effects of Telomere Loss and Cooperates with Telomere Dysfunction to Accelerate Carcinogenesis.</a> Cell. 97 (4), 527-538 (1999).</li>
<li>Counter, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Telomere+shortening+associated+with+chromosome+instability+is+arrested+in+immortal+cells+which+express+telomerase+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Embo.+J%22%5BJournal%5D)">Telomere shortening associated with chromosome instability is arrested in immortal cells which express telomerase activity.</a> Embo. J. 11, 1921-1929 (1992).</li>
<li>Hayflick, L., Moorhead, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+serial+cultivation+of+human+diploid+cell+strains%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Cell.+Res%22%5BJournal%5D)">The serial cultivation of human diploid cell strains.</a> Exp. Cell. Res. 25, 585-621 (1961).</li>
<li>Goetz, I. E., Moklebust, R., Warren, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+some+antibiotics+on+the+growth+of+human+diploid+skin+fibroblasts+in+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22In+Vitro%22%5BJournal%5D)">Effects of some antibiotics on the growth of human diploid skin fibroblasts in cell culture.</a> In Vitro. 15 (2), 114-119 (1979).</li>
<li>Coriell, L. L. Methods of prevention of bacterial, fungal, and other contaminations. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCoriell%2C+LL+%22Contamination+in+Tissue+Culture%22">Contamination in Tissue Culture</a>. Fogh, J. . , Academic Press. 29-49 (1973).</li>
<li>Hambor, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioreactor+Design+and+Bioprocess+Controls+for+Industrialized+Cell+Processing%5BTitle%5D)+AND+%22Bioprocess+Tech.+Bull%22%5BJournal%5D)">Bioreactor Design and Bioprocess Controls for Industrialized Cell Processing.</a> Bioprocess Tech. Bull. 10 (6), 22-33 (2012).</li>
<li>Abbot, A., Cyranoski, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biology%E2%80%99s+new+dimension%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Biology’s new dimension.</a> Nature. 424, 870-872 (2003).</li>
</ol>

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

<html> وقد يؤدي تزايد المخاوف بشأن تدفق الأنواع الغازية الزراعية إلى زيادة الطلب على منهجيات جديدة للدفاع ضد الآفات ومسببات الأمراض الناشئة. وتركز الوقاية من الأمراض وإدارة ينطوي إدارة ناقلات الممرض وكان الهدف الرئيسي من هذه الدراسة. الاقتصاد تلعب دورا حيويا في قرار لإنتاج هذا النوع من المبيدات الحيوية لإدارة ناقلات الممرض في الزراعة لأن التطبيق العملي يحتاج إلى كميات كبيرة على مساحات واسعة ولكن بتكلفة منخفضة 12. أصبحت ممارسة استخدام زراعة الخلايا للبحث والتطوير شائعا بش...

تم التعرف التصويب زجاجي الجناحين (Homalodisca vitripennis في Germar 1821) باعتباره المسيطر من Xylella fastidiosa (اكس fastidiosa)، العامل المسبب للمرض بيرس من الكرمة (PD) في أمريكا الشمالية 1. إدارة السكان الحشرات سرعان ما أصبح محور البحوث لمكافحة هذه المشكلة المدمرة لصناعة زراعة الكروم في ولاية كاليفورنيا وعبر جنوب الولايات المتحدة. A-بالمعنى الإيجابي، واحد الذين تقطعت بهم السبل فيروس RNA عائلة Dicistroviridae، Homalodisca-01 فيروس تم التعرف coagulata (HoCV-01) في H. البرية السكان vitripennis وتبين أن زيادة معدل الوفيات في هؤلاء السكان 2-4، في حين خفض مقاومة الحشرات للمبيدات الحشرية. تطوير أساليب فعالة إلى الخلف المصابة H. كانت vitripennis إلى مرحلة البلوغ في إعداد مختبر صعبا بسبب <eم&gt; H. vitripennis لديها مختلف الاحتياجات الغذائية مراحل محددة تتطلب مجموعة متنوعة من النباتات المضيفة 5-8. ويلزم مرافق محددة لH. الحي الخلفي vitripennis في الولايات المتحدة؛ وبالتالي، ثقافة الخلية هي أكثر اقتصادا وبديلة قابلة للحياة، فضلا عن الحيوية على نحو متزايد لHoCV-01 كشف والتكرار 2،9. حين طرق أساسية لإنشاء مزارع الخلايا من H. يتم وصف vitripennis، ولم تستخدم هذه الأساليب للإنتاج التجاري من عوامل المكافحة البيولوجية، مثل الفيروسات 2. الهدف العام المتمثل في الإجراءات التالية هو إنتاج نسبة عالية من HoCV-01 مناسبة للاستخدام كعامل المكافحة البيولوجية. يتطلب تكاثر الفيروس الخلية الحية، وهذا هو السبب زراعة بنجاح وتحسين H. الثقافات vitripennis أمر حيوي لتقدم مستويات إنتاج مربحة من الفيروس.

<table><tbody><tr><td>قوارير زراعة خلايا كورنينج</td><td>سيجما ألدريتش</td><td>CLS430168</td><td>مساحة السطح 25 سم < سوب > 2 < / سوب> ، رقبة معلقة ، غطاء (ختم سدادة)</td></tr> <tr><td>أوليمبوس DP30BW ، IX2-SP ، IX71</td><td>أوليمبوس</td><td></td><td>مجهر مقلوب وكاميرا</td></tr><tr><td>محلول تريبسين-EDTA</td><td>سيجما ألدريتش</td><td>T4049</td><td>0.25٪ ، مصفى معقم ، كاشف حيوي ، مناسب لزراعة الخلايا ، 2.5 جم من التربسين الخنازير و 0.2 جم EDTA & bull ؛ 4Na لكل لتر من Hanks & prime; محلول ملح متوازن مع الفينول الأحمر</td></tr><tr><td>Greiner ألواح استزراع الآبار</td><td>المتعددة Sigma Aldrich</td><td>M8937</td><td>48 بئرا (TC معالج بغطاء)</td></tr> <tr><td>DETCA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>228680</td> ثنائي <td>إيثيل ديثيوكاربامات ثلاثي هيدرات الصوديوم</td></tr> نظام <tr><td>تصفية الفراغ أعلى الزجاجة Corning</td><td>Sigma Aldrich</td><td>CLS431206</td><td>غشاء أسيتات السليلوز ، حجم المسام 0.45 مو ؛ م ، مساحة الغشاء 54.5 سم < سوب > 2 < / سوب> ، سعة الفلتر 500 مل</td></tr><tr><td>بريج 52</td><td>سيجما ألدريتش</td><td>388831</td><td>البولي إيثيلين جلايكول سداسي ديسيل الأثير</td></tr><tr><td>محلول عازلة الفوسفات</td><td>سيجما ألدريتش</td><td>P5244</td><td>تم استلامه على شكل 100 ملي مولار مخفف إلى 10 ملي مولار بماء معقم</td></tr><tr><td>TRIzol LS</td><td>Life Technologies</td><td>10296-028</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A5304</td><td>ل الرحلان الكهربائي</td></tr><tr><td>بروميد الإيثيديوم</td><td>سيجما ألدريتش</td><td>E7637</td><td>الكاشف الحيوي ، للبيولوجيا الجزيئية ، مسحوق</td></tr><tr><td>QIAquick</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td></td></tr><tr><td>QuantiTect qRT-PCR kit</td><td>Qiagen</td><td>204243</td><td></td></tr><tr><td>4٪ بارافورمالديهايد</td><td>سيجما ألدريتش</td><td>P6148</td><td>درجة الكاشف ، بلوري</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P5368</td><td>فوسفات محلول ملحي</td></tr><tr><td>مخزن Triton X-100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>X100</td><td></td></tr><tr><td>ألبومين مصل الأبقار (BSA)</td> <td>Sigma Aldrich</td><td>A2153</td><td></td></tr><tr><td>الرودامين الأحمر المترافق القضيبين</td><td>Life Technologies</td><td>R415</td><td>Rhodamine phalloidin عبارة عن مسبار F-actin عالي التقارب مقترن بصبغة الفلورسنت الحمراء البرتقالية ، رباعي ميثيل رودامين</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D9542</td><td></td></tr> تقنيات <tr><td>كاشف كاشف ProLong Gold المضاد للبهتان</td><td>P36934</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LSM510 النظام البؤري الميتا</td><td>كارل زايس</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LSM Zen 2007 برنامج</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Grace s وسط حشرات (مكمل ، 1x)</td> <td>Sigma Aldrich</td><td>G8142</td><td>H2G + نطاط أوراق مكون متوسط</td></tr><tr><td>L-histidine monohydrate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H8125</td><td>H2G + نطاط أوراق مكون متوسط</td></tr><tr><td>متوسط 199 (10x)</td> <td>Sigma Aldrich</td><td>M4530</td><td>H2G + نطاط أوراق مكون متوسط</td></tr><tr><td>متوسط 1066 (1x)</td> <td>Sigma Aldrich</td><td>C0422</td><td>H2G + مكون</td></tr> <tr><td>متوسط نطاط الأوراقهانك s أملاح متوازنة (1x)</td> <td>Sigma Aldrich</td><td>51322C</td><td>H2G + نطاط أوراق مكون متوسط</td></tr><tr><td>L-Glutamine (100x)</td> <td>Sigma Aldrich</td><td>G3126</td><td>H2G + نطاط أوراق مكون متوسط</td></tr><tr><td>MEM ، مزيج الأحماض الأمينية (50x)</td> <td>Sigma Aldrich</td><td>56419C</td><td>H2G + نطاط الأوراق مكون</td></tr><tr><td>متوسط 1 M محلول MgCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M8266</td><td>H2G + نطاط أوراق مكون متوسط</td></tr><tr><td>Pen-Strep (ث / الجلوتامين)</td> <td>سيجما ألدريتش</td><td>G6784</td><td>H2G + نطاط أوراق مكون متوسط</td></tr><tr><td>Nystatin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>N6261</td><td>H2G + نطاط الأوراق مكون متوسط</td></tr><tr><td>Gentamycin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>46305</td><td>H2G + نطاط أوراق مكون متوسط</td></tr><tr><td>سكر العنب</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D9434</td><td>H2G + نطاط أوراق مكون متوسط</td></tr><tr><td>مصل الأبقار الجنيني</td><td>سيجما ألدريتش</td><td>F2442</td><td>H2G + نطاط الأوراق المكون المتوسط</td></tr></tbody></table>

نشر<em&gt; homalodisca coagulata فيروس-01</em&gt; عبر<em&gt; homalodisca vitripennis</em&gt; الثقافة خلية

Propagation of Homalodisca coagulata virus-01 via Homalodisca vitripennis Cell Culture

التصويب زجاجي الجناحين (Homalodisca vitripennis) هو حشرة vagile للغاية ومتعددة العائل جدت في جميع أنحاء جنوب غرب الولايات المتحدة. هذه الحشرات هي ناقلات الغالبة من Xylella fastidiosa (اكس fastidiosa)، وهي بكتيريا محدودة الخشب الذي هو العامل المسبب للمرض بيرس (PD) من الكرمة. مرض بيرس غير ضار اقتصاديا؛ وبالتالي، H. أصبحت vitripennis هدفا لاستراتيجيات إدارة الممرض. ارتبط وdicistrovirus يدعى Homalodisca coagulata فيروس-01 (HoCV-01) مع زيادة في الوفيات H. السكان vitripennis. لأنه مطلوب الخلية المضيفة لHoCV-01 التكرار، توفر زراعة الخلايا بيئة موحدة للنسخ المتماثل المستهدفة التي هي لوجستيا واقتصاديا قيمة لإنتاج المبيدات الحيوية. في هذه الدراسة، ونظام للنشر على نطاق واسع من H. وقد تم تطوير خلايا vitripennis عن طريق زراعة الأنسجة، صroviding آلية تكاثر الفيروس. تم استخراج HoCV-01 من الحشرات الجسم كله ويستخدم لتطعيم H. مثقف خلايا vitripennis على مستويات مختلفة. تمت إزالة مستنبت كل 24 ساعة ل168 ساعة، وتحليل الحمض النووي الريبي المستخرج مع QRT-PCR. تم صبغ الخلايا مع الأزرق التريبان وعدها لتحديد البقاء على قيد الحياة الخلية باستخدام المجهر الضوئي. تم استخراج جزيئات الفيروس كلها تصل إلى 96 ساعة بعد الإصابة، التي كانت نقطة زمنية مصممة على أن تكون قبل حدوث الانهيار التام ثقافة الخلية. تعرض الخلايا أيضا إلى تلطيخ الفلورسنت وعرضها باستخدام متحد البؤر المجهري للتحقيق في النشاط الفيروسي على F-أكتين التعلق ونوى النزاهة. الاستنتاج من هذه الدراسة هو أن H. vitripennis خلايا قادرة على المستزرعة وتستخدم لانتاج كميات كبيرة من HoCV-01 على مستوى مناسب للسماح إنتاج المبيدات الحيوية.

كان ينظر مرفق الخلية والنمو خلال 48 ساعة من مرور في كل من قوارير ثقافة الصغيرة والكبيرة، من ثقافات الابتدائية والممرات استمرار. وقد لوحظ نمو الخلايا الليفية والتنمية أيضا ضمن هذا الإطار الزمني. عندما تم بالانزعاج قوارير المصنفة حديثا قبل 48 ساعة، كان هناك انخفاض واضح في مرفق الخلية، مما يؤدي إلى تزايد الثقافات أبطأ وأحيانا لا يوجد مرفق أو نمو على الإطلاق. كانت خلايا حوالي 80٪ متموجة خلال أسبوع واحد من وفاة وشكلت أحادي الطبقة في 10-14 يوما (الشكل 1). وقد نجا الثقاف...

هنا نقدم بروتوكول لنشر خلايا Homalodisca vitripennis وHoCV-1 في المختبر. تمت إزالة المتوسطة من HoCV-1 الثقافات الإيجابية والحمض النووي الريبي المستخرج كل 24 ساعة عن 168 ساعة. وكان كميا البقاء على قيد الحياة الخلية تلطيخ التريبان الأزرق. تم استخراج جزيئات الفيروس كاملة بعد الإصابة. وكان كميا الحمض النووي الريبي المستخرج من QRT-PCR.

نشر<em&gt; Homalodisca coagulata فيروس-01</em&gt; عبر<em&gt; Homalodisca vitripennis</em&gt; الثقافة خلية

The glassy-winged sharpshooter (Homalodisca vitripennis) is a highly vagile and polyphagous insect found throughout the southwestern United States. These ...

الهدف العام من التجربة التالية هو تحديد ما إذا كان من الممكن مضاعفة فيروس Homalodisca coagulata virus one أو HOCV-one باستخدام مستنبتات خلايا Homalodisca vitripennis، ومن ثم استخلاصه لاستخدامه في تطبيقات لاحقة. يتم تحقيق ذلك من خلال استزراع H. vitripennis بنجاح لإدخال HOCV-one المنقى من أجل المضاعفة. وكخطوة ثانية، يتم إزالة الوسط والخلايا التي تحتوي على الفيروس من المستنبت، والتي تخضع بعد ذلك لعمليات استخلاص الفيروس و RNA.بعد ذلك، يتم إخضاع الـ RNA المستخلص من المستنبتات المصابة لتفاعل PCR من أجل تحديد ما إذا كان الـ RNA الفيروسي موجوداً في الخلايا. وتظهر النتائج أن HOCV one يمكن أن يتضاعف في الجسم الحي (in vivo) بناءً على تعداد الخلايا الحية قبل الإصابة وبعدها وتحليل qRT-PCR.تكمن الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالطرق الحالية، مثل تربية حشرات حية مصابة، في كونها أكثر اقتصادية وأسهل في الإدارة باستخدام حد أدنى من المرافق والمعدات. ويمكن أن يساعد استخدام هذه الطريقة في الإجابة على أسئلة جوهرية في مجال المكافحة البيولوجية؛ فعلى سبيل المثال، هل يمكن استخدام فيروس حشري أو فيروس متخصص لنوع معين من الحشرات لمكافحة آفة على نطاق واسع؟على الرغم من أن هذه الطريقة يمكن أن توفر رؤى حول إدارة هذه الحشرة تحديداً، إلا أنه يمكن تطبيقها أيضاً على أنظمة أخرى، مثل إدارة نمل النار الأحمر المستورد باستخدام فيروس من نفس فصيلة HOCV one. قبل البدء في هذا الإجراء، قم بزراعة وعزل المزارع في دوارق زراعة أنسجة بحجم 25 square centimeter باستخدام وسط H2G plus leaf hopper، وهو وسط نحل العسل WH-two المعدل. قم بتجنيس الأجسام الكاملة لحشرة H. vitripennis الموجبة للفيروس في محلول منظم الفوسفات مع 0.02% DETCA عن طريق الرج الدوامي على فترات زمنية تقارب عشر ثوانٍ حتى تختفي جميع تكتلات الأنسجة الكبيرة. استخلص الفيروس عبر الطرد المركزي فائق السرعة عند 22,000 g لمدة 16 hours عند درجة حرارة 4 °C.بعد التخلص من السائل الطافي، اجمع الراسب وأذبه في 5 mL من محلول منظم الفوسفات بتركيز 10 mM الذي يحتوي على 0.4% من حمض الصوديوم ديوكسي كوليك و 4% من بولي إيثيلين جليكول هيكسا-ديسال إيثر. لخلط الراسب جيداً، قم بإزالته من جدار الأنبوبة وسحقه إذا لزم الأمر. بعد ذلك، يتم إجراء عملية الطرد المركزي عند 300 g لمدة 15 دقيقة. تخلص من السائل الطافي، ثم مرر المحلول عبر مرشح بمسامية 0.45 µm واجمع الراشح في أنبوبة تجميع كبيرة.انقل الرشاحة إلى غشاء دياليز بحد قطع للوزن الجزيئي يبلغ 3.5 kilodaltons، مع استخدام كميات صغيرة من منظم الفوسفات بتركيز 10 millimolar الخالي من DETCA إذا لزم الأمر. ضع غشاء الدياليز في دورق كبير مملوء بماء مقطر مرتين عند درجة حرارة أربع °C. قم بتغيير الماء كل ساعة لمدة تتراوح من خمس إلى ست ساعات حتى يتكون راسب أبيض داخل الغشاء. عند هذه النقطة، ابدأ بزراعة الخلايا في أطباق زراعة ذات 48 بئراً.بمجرد وصول نمو الخلايا إلى نسبة 80%confluent، يتم تلقيح كل صف من الخلايا بالفيروس المخفف تسلسلياً. ثم أضف 10 µL من الماء المقطر مرتين إلى كل بئر كعينة تحكم في الحجم. ومن أجل تحديد تركيز أساسي أولي للخلايا للمقارنة مع أعداد الخلايا التجريبية، قم بفصل الخلايا في البئر الأول من كل صف قبل التلقيح الأولي لأي من الآبار في المزارع بالفيروس. ثم قم بعدّ الخلايا.بعد ذلك، قم بإزالة جميع الأوساط من العمود الذي تم تصويره عند كل نقطة زمنية مدتها 24 ساعة، واحفظها في درجة حرارة 20- درجة مئوية لاستخلاص RNA والتقدير الكمي للفيروس. بعد استخلاص الفيروس من الخلايا المستنبتة وفقاً للبروتوكول الموصوف سابقاً، قم باستخلاص RNA من عينات الأوساط التي جُمعت خلال كل تجربة فيروسية استمرت لمدة أسبوع واحد باستخدام استخلاص guanidinium thiocyanate phenol chloroform المصمم للعينات السائلة وفقاً لبروتوكول الشركة المصنعة. بالنسبة لـ RT PCR، قم بإنشاء معايير فيروسية عن طريق إجراء PCR تقليدي باستخدام زوج البادئات HOCV RT PCR primer-one مع عينة فيروسية معزولة من الجسم الكامل لـ H. vitripennisبعد ذلك، قم بإجراء سلسلة تخفيفات تسلسلية بمقدار عشرة أضعاف للعينة المنقاة، تتراوح من 57 nanograms per microliter إلى 57 attograms per microliter. حدد حدود الكشف لسلسلة التخفيفات عن طريق qRT-PCR باستخدام مجموعة qRT PCR توفر تقديرًا كميًا موثوقًا للنقاحات منخفضة الوفرة.بعد استخلاص RNA من العينات التجريبية كما تم وصفه سابقاً، يتم التحديد الكمي باستخدام القياس الطيفي. بعد ذلك، يتم إجراء qRT-PCR على جميع العينات في مكررات كتفاعلات بحجم 25 µL باستخدام طقم qRT-PCR أحادي الخطوة قادر على رصد أعداد النسخ المنخفضة كما يلي: يتم تحضير المزيج الرئيسي (master mix) بحيث يحتوي كل مزيج تفاعل على 12.5 µL من 1x master mix، و 1.0 µL منبادئ أمامي بتركيز 0.3 µM، و 1.0 µL من بادئ عكسي بتركيز 0.3 µM، و 0.25 µL من إنزيم النسخ العكسي (reverse transcriptase)، وكميات متغيرة من القالب بناءً على قيم المعايرة. ثم يُستكمل الحجم النهائي للتفاعل ليصل إلى 25 µL باستخدام ماء خالٍ من RNAs. يتم إدراج خمسة تركيزات قياسية في كل تشغيلة PCR بـ 5 × 10⁻¹⁰ و 10⁻⁸ و 5 × 10⁻⁸ و 5 × 10⁻⁶ و 5 × 10⁻⁴ و 5 × 10⁻² نسخة. يتم ضبط العتبة (threshold) لكل تشغيلة لتكون أقل بقليل من فلورية 10 × 10⁻².⁵ لتقليل الضوضاء أثناء عملية الاستحواذ المبكرة في بداية كل تشغيلة.بمجرد نمو خلايا *Homalodisca vitripennis* في طبق يحتوي على 12 بئراً وبه شرائح غطاء زجاجية، يتم تلقيح عمود واحد كل 24 ساعة لمدة أربعة أيام، وذلك بمجرد تكوين طبقة أحادية باستخدام الفيروس المستخلص. عند الانتهاء، يتم تثبيت الخلايا باستخدام 4%paraformaldehyde باردة عند درجة حرارة 4 °C لمدة 30 دقيقة. ثم يُضاف 500 µL من 1X PBS إلى الخلايا وتُغسل لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة على جهاز هزاز (rocker) بسرعة منخفضة. بعد غسل الخلايا ثلاث مرات، يُضاف 500 µL من 0.1%TritonX-100 لنفاذية الخلايا لمدة 10 دقائق.بمجرد غسل الخلايا باستخدام 1X PBS، أضف 500 µL من محلول bovine serum albumin بتركيز 5% لحجب الخلايا في درجة حرارة الغرفة. بعد مرور ساعتين، قم بإزالة المحلول من الخلايا. ثم أضف 250 µL من محلول مخفف من rhodamine-red conjugated Phalloidin إلى كل بئر لصبغ f-actin. غطِّ الطبق بورق ألومنيوم لمنع بهتان الصبغة، واحضن الخلايا عند درجة حرارة 4 °C طوال الليل. بعد فترة الحضن، أزل محلول rhodamine واستبدله بـ 250 µL من DAPI المخفف في 1X PBS الذي يحتوي على 5% BSA لصبغ نوى الخلايا. بعد حضن الخلايا في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة، اغسلها ثلاث مرات باستخدام 1X PBS كما تم وصفه سابقاً.أخيراً، قم بإزالة أغطية السدادات برفق من الآبار وثبتها على شرائح المجهر باستخدام وسط تثبيت يحتوي على كاشف مانع للتلاشي (Antifade reagent).تمت ملاحظة التصاق الخلايا وتطور الخلايا الليفية خلال 48 ساعة من عملية النقل في دوارق زراعة صغيرة وكبيرة. وعندما تعرضت الدوارق المزروعة حديثاً للاضطراب، حدث انخفاض في التصاق الخلايا مما أدى إلى نمو أبطأ للمزارع، وفي بعض الأحيان عدم حدوث التصاق أو نمو.كانت الخلايا متلاصقة بنسبة تقارب 80% خلال أسبوع واحد، وشكلت طبقة أحادية في غضون 10 إلى 14 يوماً. وأظهرت المزارع المصابة علامات على تدهور سلامة شكل الخلايا، كما ظهرت ما يبدو أنها ثقوب كبيرة على أسطح الخلايا بعد 48 ساعة من الإصابة. وانكمشت الخلايا وانفصلت عن سطح المزرعة بعد حوالي 72 إلى 96 ساعة من إصابتها بفيروس HOCV-one غير المخفف. تم رسم متوسط أعداد الخلايا الحية لتوضيح الاختلافات في وفرة الخلايا الحية بين الأحمال الفيروسية بمرور الوقت. وتشير مجموعات العلاج الفيروسي الأعلى إلى تدهور أكثر وضوحاً في صحة المزرعة مع انخفاض كبير في الخلايا الحية بين 48 إلى 72 ساعة، بينما انخفضت المجموعات الفيروسية الأقل تدريجياً حتى تدهورت عند حوالي 144 ساعة. وكانت احتمالية بقاء الخلايا الملقحة بمعالجات فيروسية أعلى أقل، كما تم اختباره بواسطة منحنيات Kaplan Meyer، وهو ما يتوافق مع تحليلات متوسط عدد الخلايا الحية. ورغم أنها ليست ذات دلالة إحصائية، إلا أن البيانات تشير إلى أن الخلايا المعرضة للفيروس تزيد احتمالية إظهارها لمعدلات بقاء أقل بمرور الوقت بنسبة 88%. ويشير تناقص الأنوية الموجودة بالإضافة إلى المظهر المشوه لـ f-actin في الخلايا المعرضة لفيروس HOCV-one إلى تأثير كبير على المزرعة.أظهرت الخلايا السليمة التي تعرضت لحمل فيروسي أعلى بمقدار 10 أضعاف درجة أكبر من الإجهاد. وأثناء تنفيذ هذا الإجراء، من المهم تذكر إكمال كل خطوة في البروتوكول في الوقت المحدد، حيث إن بعض الخطوات حساسة للوقت ودرجة الحرارة. وبعد تنفيذ هذا الإجراء، يمكن استخدام طرق أخرى مثل ELISA للإجابة على أسئلة جوهرية، على سبيل المثال، ما هي كمية الفيروس الموجودة في مزرعة خلوية بعد تلقيح تلك المزرعة بكميات متفاوتة من الفيروس؟ بعد مشاهدة هذا الفيديو، سيكون لديك فهم جيد لكيفية استخدام خط خلايا حشرية لتكثير فيروس RNA، واستخلاص ذلك الفيروس ثم تقديره كمياً باستخدام qRT-PCR.

propagation-homalodisca-coagulata-virus-01-via-homalodisca

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

علم المناعة والعدوى

في هذا الفيديو نستخدم اتش تحمل الجينات recombinase لجنة المساواة العرقية لتصيب الخلايا الليفية الماوس الأولية الجنينية يحمل floxed Rac1 أليل.

اتش بوساطة إزالة الجزيئات الجينية في اشارة الى مثقف الخلايا الليفية الماوس الأولية الجنينية

نحن تصف طريقة لعملية وشاشة الميدانية التي تم جمعها. البعوض لمجموعة متنوعة من الفيروسات من خلال فحص خلايا فيرو الثقافة من خلال استخدام هذه التقنية ، وقد اكتشفنا 9 فيروسات مختلفة من الأسر التصنيفية 4 في البعوض التي تم جمعها في ولاية كونيتيكت.

الكشف عن الفيروسات المعدية التي جمعت من الحقل عن طريق البعوض فيرو خلية الفحص الثقافة

Source: Jamieson, T. R., et al. Detection of SARS-CoV-2 Neutralizing Antibodies using High-Throughput Fluorescent Imaging of Pseudovirus Infection. J. Vis. Exp. (2021)This video demonstrates the procedure for infecting mammalian cells with green fluorescent protein (GFP)-encoding pseudovirus, monitoring viral replication and spread by fluorescence microscopy, and collecting virus-containing supernatant for downstream applications.

Production and Collection of Pseudovirus Particles Using Mammalian Cell Culture

Source: Nguyen, H., et al. Growth, Purification, and Titration of Oncolytic Herpes Simplex Virus. J. Vis. Exp. (2021).This video demonstrates the propagation and harvesting of oncolytic herpes simplex virus in mammalian cell cultures, highlighting viral entry, replication, and the recovery of virus-loaded cells. It further shows methods for preserving infected cells for downstream processing.

Propagation and Harvesting of Oncolytic Herpes Simplex Virus in Mammalian Cells

Source: Huang, D., et al. Mosquito-Associated Virus Isolation from Field-Collected Mosquitoes. J. Vis. Exp. (2022).This video demonstrates the step-by-step procedure for the in vitro isolation of mosquito-associated viruses from mosquito homogenates using fibroblast-like mammalian cells.

Isolation of Mosquito-Associated Virus from Mosquito Homogenate

فيروس جدري (VV) وقد استخدم على نطاق واسع في البحوث الطبية الحيوية وتحسين صحة الإنسان. توضح هذه المقالة طريقة بسيطة وفعالة للغاية لتحرير الجينوم VV باستخدام نظام كريسبر-Cas9.

مقاربة بسيطة وفعالة لبناء ناقلات الفيروسات المسخ الوقس

هربس من الديك الرومي (هفت) يستخدم على نطاق واسع كمنصة متجه لتوليد المؤتلف لقاحات ضد عدد من الأمراض إنفلونزا الطيور. توضح هذه المقالة نهج بسيط وسريع لجيل اللقاحات المؤتلف فيكتوريد هفت تستخدم نظاما متكاملا نهيج-كريسبر/Cas9 ولوكس Cre.

توليد نواقل هربس إنفلونزا الطيور المؤتلف مع كريسبر/Cas9 الجينات تحرير

هذا البروتوكول يصف كيفية إنشاء العدوى الفيروسية في فيفو في المورفولوجية ميلانوجاستير باستخدام أسلوب الحقن نانو والتقنيات الأساسية لتحليل التفاعل الفيروس--المضيف.

إنشاء العدوى الفيروسية، وتحليل التفاعل المضيف للفيروسات في Melanogaster المورفولوجية

يصف هذا البروتوكول عمليه تجريبية لإنتاج الجسيمات الفيروسية المعدية عاليه التهاب (pp) مع البروتينات السكرية المغلفة من اثنين من سلالات الإنفلونزا A وكيفيه تحديد عدويها. هذا البروتوكول هو قابل للتكيف للغاية لتطوير pps من اي نوع آخر من الفيروسات يلفها مع البروتينات السكرية مغلف مختلفه.

إنتاج جسيمات الإنفلونزا المعدية العالية التهابات بالمغلفات بالبروتينات السكرية المسببة للامراض الشديدة H5N1 وفيروسات الطيور H7N9

وصف هنا هو وسيلة فعالة على كيفية إنتاج ارتفاع الأسهم تتر الفيروسية من فيروس التهاب الكبد E (HEV) لتصيب خلايا الورم الكبدي بكفاءة. مع طريقة عرض، سواء غير مغلفة، وكذلك الجسيمات الفيروسية المغلفة يمكن حصادها واستخدامها في تلقيح خطوط الخلايا المختلفة.

نموذج ثقافة الخلية لإنتاج ارتفاع الأسهم فيروس التهاب الكبد Titer E

تم العثور على العديد من التسلسلات الجديدة الشبيهة بالفيروسات في البعوض بسبب الاستخدام المكثف لتقنيات التسلسل. نحن نقدم إجراء فعالا لعزل الفيروسات وتضخيمها باستخدام الفقاريات وخطوط خلايا البعوض ، والتي قد تكون بمثابة أساس للدراسات المستقبلية حول الفيروسات المرتبطة بالبعوض ، بما في ذلك الفيروسات التي ينقلها البعوض والفيروسات الخاصة بالبعوض.

عزل الفيروسات المرتبطة بالبعوض من البعوض الذي تم جمعه في الحقول

اكتشف بروتوكولًا لاستنساخ فيروس HoCV-1 في خلايا Homalodisca vitripennis واستخراج الحمض النووي الريبوزي لتقييم التكاثر الفيروسي. تساعد هذه الطريقة الباحثين على دراسة ديناميكيات الفيروسات وتفاعلاتها مع المضيف.

نشر

استكشف المزيد من الفيديوهات