Vibratome باجتزاء شبكية العين الفأر لإعداد الثقافات مبصرة

الهدف العام من هذا الإجراء هو عزل طبقة المستقبلات الضوئية للفأر. للزراعة ، تتمثل الخطوة الأولى في الحصول على شبكية مسطحة كاملة وإغلاقها على كتلة الجيلاتين. بعد ذلك ، يتم قطع طبقات الشبكية بنجاح من أجل عزل طبقة المستقبلات الضوئية.

الخطوة الأخيرة هي زرع خلايا مستقبلات ضوئية منقاة في الثقافة. في النهاية ، يتم تأكيد نقاء طبقة المستقبلات الضوئية عن طريق الفحص المجهري والتألق المناعي ، متبوعا باختبار عامل الجدوى المخروطي المشتق من القضيب. الميزة الرئيسية لهذه التقنية على الطرق الحالية مثل التشريح الدقيق بالليزر ، هي عزل طبقة المستقبلات الضوئية بثقة.

تمتد الآثار المترتبة على هذه التكنولوجيا إلى علاج تنكس الشبكية الوراثي. نظرا لأنه من الملائم جدا دراسة بيولوجيا المستقبلات الضوئية ، فقد قمنا في الأصل بتطوير هذه الطريقة لدراسة التفاعل الخلوي بين المستقبلات الضوئية القضيبية والباردة. أدى زرع مستقبلات ضوئية في عين المبكرة إلى تحديد جميع عوامل القابلية للحياة المشتقة.

العرض المرئي لهذه الأساليب أمرا بالغ الأهمية حيث يصعب أداء فرصة شبكية العين الجبلية المسطحة لأنها صعبة. قبل عزل شبكية العين ، قم بإعداد الاهتزاز. ابدأ بأطباق من محلول جيلاتين 20٪ يتم إخراجها من التخزين عند أربع درجات مئوية.

اقطع الجيلاتين بمشرط ، ثم اقلب شريحة الجيلاتين وألصقها على قرص الدعم الأسود للهزاز باستخدام قطرة من الغراء الفائق. بعد ذلك ، قم بتقسيم شفرة الحلاقة إلى نصفين وأدخل نصفا في الهزاز. ثم أدخل قرص الدعم الأسود على جهاز الهزاز وأدر المقبض الأسود إلى اليمين.

الآن ، قم بتأمين وعاء التثبيت على رأس الاهتزاز وقم بتغطية كتلة الجيلاتين بوسط مستقل CO2. قم بتشغيل الاهتزاز لاختبار الإعداد. قطع ثلاث شرائح 100 ميكرون حتى تصبح الشرائح ناعمة ويتم إنتاج شرائح مسطحة.

بعد حصاد العينين من الفأر والمستحضرات الأخرى ، قم بعزل شبكية العين. أولا ، استخدم إبرة قياس 18 لعمل ثقب على مستوى طرف العين. ثم لإزالة الجسم الهدبي ، أدخل مقصا مستقيما من خلال الفتحة وفي كرة العين ، وقم بقص الصلبة بعناية أسفل القزحية ، ثم على طول محيط الكرة

بعد ذلك ، حافظ على الجزء الخلفي من العين مع شبكية العين متجاورة للصلبة وقم بإزالة القرنية والعدسة. باستخدام قبضتين دقيقتين ، قم بإزالة الجسم الزجاجي المتصل بشبكية العين دون الإضرار بالشبكية حتى يمكن وضع شبكية العين بشكل مسطح. قم بعمل أربع قطع شعاعية فيه.

الآن اقلب الكرة العينية وقشرها مثل البرتقال. بعد ذلك ، بعناية فائقة باستخدام مقص مستقيم ناعم. افصل الشبكية عن الصلبة والظهارة المصطبغة بالشبكية.

يجب أن يظل متصلا على مستوى العصب البصري باستخدام قبضة دقيقة ، وافصل الجسم الزجاجي المتبقي بدءا من المحيط ويتحرك نحو مركز شبكية العين. مع إزالة كل الجسم الزجاجي تماما ، سوف تتسطح شبكية العين. الآن انقل شبكية العين إلى طبق بتري بقطر 35 ملم.

تعتبر عملية إغلاق شبكية العين المسطحة في كتلة الجيلاتين حساسة وهي في الأساس الجانب الأكثر تحديا لتقسيم الأنسجة. أولا ، قم بإزالة 20 إلى 30 مل من الوسط من خزان الاهتزاز. ثانيا ، انقل شبكية العين إلى شريحة زجاجية باستخدام ماصة بلاستيكية عريضة التجويف وقم بتطبيق قطرة من CO2 وسط مستقل على الشريحة.

ثالثا ، انقل شبكية العين إلى شريحة جيلاتين مع توجيه مستقبلات ضوئية لأسفل. رابعا ، اربط شبكية العين بكتلة الجيلاتين. قم بحقن الجيلاتين الدافئ بنسبة 4٪ برفق على جانب واحد من الكتلة بين شبكية العين وكتلة الجيلاتين وطرد الجيلاتين على الجانب الآخر.

أخيرا ، قم بشفط الجيلاتين بماصة زجاجية وانتظر من سبع إلى 10 دقائق حتى يتم إغلاق شبكية العين في الكتلة. أضف الآن CO2 وسيطا مستقلا مرة أخرى إلى الخزان ، واغمر الكتلة والشفرة للتقسيم بدءا من أعلى كتلة الجيلاتين. قطع 100 ميكرون أقسام تسلسلية حتى تصل الشفرة إلى شبكية العين.

ثم باستخدام سرعة بطيئة جدا ، مثل واحد أو اثنين من قطع 100 إلى 120 ميكرون من الطبقة الداخلية لشبكية العين. اعتمادا على التطبيق ، يمكن التخلص من هذه الطبقة أو تخزينها في النيتروجين السائل ، مما يحافظ على السرعة بطيئة عند الواجهة بين الطبقة الداخلية والخارجية. خذ أقساما 15 ميكرون.

افحص هذه الأقسام تحت المجهر بحثا عن وجود الأوعية الدموية. عندما لا يكون هناك أي شيء ، يتم الوصول إلى شبكية العين الخارجية من خلال الطبقة الخارجية. قطع ببطء 200 أجزاء ميكرون.

انقل هذه الشرائح إلى طبق 35 ملم مع ثلاثة ملليلتر من البارد ، CO2 وسط مستقل محفوظ على الجليد. استمر في جمع جميع أقسام طبقة المستقبلات الضوئية من جميع شبكية العين ليتم تقسيمها إلى هذا الطبق. ابدأ بنقل المستقبلات الضوئية المقطعة إلى حاضنة 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.

ثم باستخدام الملقط ، افصل برفق كل طبقة مستقبلات ضوئية عن الجيلاتين وانقلها إلى طبق جديد مملوء بثلاثة ملليلتر من محلول الرنين في درجة حرارة الغرفة. بمجرد عزل جميع المستقبلات الضوئية من الجيلاتين ، امزج وحدتين من غراء مع 25 ميكرولتر من محلول المنشط في أنبوب بولي بروبيلين معقم سعة خمسة ملليلتر واحتضانه لمدة 30 دقيقة. لتنشيط غراء أثناء هذه الحضانة ، قم بتقطيع شرائح طبقة المستقبلات الضوئية إلى قطعتين مربعتين وليس أصغر بكثير.

انقل هذه القطع إلى أنبوب خمسة ملليلتر مع 1.5 مل من محلول الرنين. ثم استنشق الرنين واستبدلها للغسيل الثاني. انتظر حتى تستقر جميع الشرائح عن طريق الجاذبية والترسيب ، ثم قم بإزالة كل محلول الرنين المتبقي من الأنبوب.

بعد ذلك ، أضف 475 ميكرولترا من محلول الجرس إلى الأنبوب الذي يحتوي على غراء المنشط واخلطه. انقل هذا الخليط إلى الأنبوب الذي يحتوي على الشرائح واحتضنه لمدة 20 دقيقة. بعد 20 دقيقة ، أوقف هضم غراء عن طريق إضافة مليلتر واحد من 10٪ FCS في DMEM.

ثم أضف 25 وحدة من D Ns.One لهضم الحمض النووي من الخلايا المستقبلة للضوء التي ماتت بعناية ، وقم بتجانس المعلق بسحب العينة لحنك الخلايا المستقبلة للضوء. قم بتدوير الأنبوب عند 115 جي ثانية لمدة ست دقائق في درجة حرارة الغرفة ، وتخلص من المادة الطافية وأعد تعليق الخلايا في DMEM المكملة باستخدام ماصة سعة مليلتر واحد. كرر هذا ، قم بالدوران وتعليق إعادة التحرير. مرة.

الآن من العين المحصودة ، يجب أن تكون خلية واحدة إلى 1.5 مليون خلية جاهزة للبذر. قم بزرعها في 100،000 خلية لكل سنتيمتر مربع وزرعها لمدة خمسة أيام قبل التطبيقات النهائية باستخدام الطرق الموصوفة ، تم صنع مزارع الخلايا المستقبلة للضوء من الفئران البرية في اليوم الثامن بعد الولادة. بدون FCS ، تم تثبيت الخلايا وتلطيخها من أجل مقاومة الصف أو علامة سابقة مضادة للترهل.

كان عدد أقل من الخلايا إيجابيا للصف المضاد لأن SAG يسبق تعبير ROE. تم تحضير المستقبلات الضوئية أيضا من الفئران البالغة من العمر 35 يوما لفحص التعبير عن mRNA ، وترهل RO والمخروط الذي ينقل GA اثنين. تعبر هذه الجينات بشكل بارز في المستقبلات الضوئية مقارنة بالدماغ كله.

يتم التعبير عن G NAT اثنين على وجه التحديد بواسطة المخاريط. تم فحص التعبير البروتيني ل RO و g. NAT اثنين في المستقبلات الضوئية من خلال مقارنة خلايا طبقة المستقبلات الضوئية مع خلايا طبقة الشبكية الداخلية.

تم ذلك بالنوع البري ومع الفئران المتحولة RD. لم تظهر الفئران الطافرة أي تعبير عن أي من البروتينين في اليوم 35. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية الحصول على طبقة مستقبلات ضوئية منقاة مناسبة.

يمكن إجراء هذه التقنية في حوالي خمس إلى ست ساعات لمدة أربع إلى ثماني شبكية إذا تم إجراؤها بشكل صحيح بعد هذا الإجراء. أيضا ، يمكن تنفيذ طرق مثل الدم الغربي من أجل الإجابة على سؤال إضافي مثل تعبير البروتين أثناء تنكس المستقبلات الضوئية بعد تطوره. مهدت هذه التقنية الطريق للباحث في مجال بيولوجيا الشبكية لدراسة النسخة والبروتين والتمثيل الغذائي للنماذج الحيوانية ذات الصلة.