ترنسفكأيشن كفاءة عالية من الإنسان THP-1 الضامة بواسطة Nucleofection

الهدف العام من هذا الإجراء هو نقل البلاعم البشرية THP بشكل موثوق مع قابلية عالية للحياة الخلوية وعدم تنشيط الخلية. يتم تحقيق ذلك عن طريق التفريق المسبق الأول بين THP واحد وحيدة لمدة 48 ساعة. الخطوة الثانية من الإجراء هي فصل البلاعم المبكرة TP واحد.

الخطوة الثالثة هي نقل الخلايا باستخدام الحمض النووي الريبي أو البلازميد ، باستخدام تقنية عامل النواة في لونزا. الخطوات النهائية هي إعادة زرع الخلايا وتمييزها بشكل أكبر. في النهاية ، يمكن إظهار الضربة القاضية الناجحة للجينات أو الإفراط في التعبير عنها من خلال تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي في الوقت الفعلي ، واللطخة الغربية ، وما إلى ذلك.

الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بأساليب التعدي الأخرى مثل الدهون ، هي أنه يمكننا تحقيق كفاءة عالية في التعدي جنبا إلى جنب مع قابلية عالية للخلية للحياة ، وأننا لا نغير وظيفة وسلوك microphage. لسوء الحظ ، هذه التقنية ليست مناسبة لتطبيقات البث العالي حيث لا يمكن إجراء المزيد من الشفافية المكثفة في وقت واحد لهذا البروتوكول. استزرعت THP خلية واحدة في RPMI 1640 مع 10٪ FCS ومع 1٪ بكتيريا القلم L الجلوتامين قبل 24 ساعة من التعدي ، انقسام الخلايا وتزويدها بوسائط جديدة.

في اليوم التالي. قم مسبقا بتمييز الخلايا عن طريق زرع 10 إلى 15 مليون خلية في قارورة نسيجية مساحتها 75 سنتيمترا مربعا مع الإضافات التالية إلى وسط RPMI المكمل ، و 1٪ من الأحماض الأمينية غير الأساسية ، و 1٪ بيروفات الصوديوم ، و 10 نانوغرام لكل مليلتر ، و PMA و 50 ميكرومولار بيتا ميركابتو إيثانول بعد 48 ساعة ، واستنشق الوسائط واستبدلها بستة ملليلتر من Accutane. تم تسخين المرء إلى 37 درجة مئوية لفصل الخلايا.

احتضنهم لمدة 30 دقيقة أثناء الحضانة. قم بإعداد وسيط تعداء كاف ووسط زراعة لرعاية ما بعد النواة للخلايا. بعد 30 دقيقة ، تأكد من انفصال الخلايا وانظر حولها.

إذا كانت بعض الخلايا لا تزال متصلة، فقم بضخ القارورة برفق باستخدام ماصة دقيقة أو استخدم تحريكا بسيطا لفصلها. لا تستخدم مكشطة. انقل التعليق إلى أنبوب سعة 15 مليلتر وقم بطرده المركزي لمدة خمس دقائق عند 300 جي في الثانية وفي درجة حرارة الغرفة ، وقم بإزالة المادة الطافية عن طريق الشفط وإعادة تعليق حبيبات الخلية.

في مليلتر واحد من RPMI ، متوسط التسخين إلى 37 درجة مئوية ، قم بحساب الخلايا وقم بعمل نقابات أنبوب نفايات صغيرة تحتوي على مليونين إلى مليونين ونصف الخلية للتعداء الفوري. من الضروري التنفيذ السريع لهذا البروتوكول. لتجنب فقدان نفوق الخلايا ، تأكد من إعداد جميع المواد مسبقا جهاز الطرد المركزي الأول ، وجميع كميات التعدي لمدة 10 دقائق عند 250 GS وفي درجة حرارة الغرفة أثناء دورانها لأسفل ، قم بتحميل جميع الأطباء البيطريين المستجيب للنواة بنصف ميكروغرام من الحمض النووي البلازميد أو ميكروغرام واحد من SI RNA استخدم تخفيفا عالي التركيز بحيث يشغلون حجما ضئيلا من الطبيب البيطري.

الآن استنشق المادة الطافية من واحدة فقط من الخلية التي تقتبس النسخ العنيف. الخلايا إلى 100 ميكرولتر في محلول عامل النواة. لا تدع الخلايا تتعرض للمحلول لأكثر من 15 دقيقة.

انقل الخلايا إلى الطبيب البيطري Q واخلطها بنقر لطيف. ثم قم بنقل الخلايا باستخدام البرنامج Y 0 0 1 على نموذج اثنين من عامل النواة B. باستخدام ماصة يمكن التخلص منها ، انقل الخلايا الكهربائية إلى قارورة تفاعل وأضف على الفور نصف مليلتر من وسيط التعداء المحذر مسبقا إلى الخلايا.

استمر الآن في تكرار العملية مع كل حصة من الخلايا واحدة تلو الأخرى حتى يتم نقلها جميعا. بعد الانتهاء من عاطفة النواة ، انقل كل تعداء للخلايا إلى بئر من ستة ألواح بئر مع 2.5 مل من وسائط التعداء الدافئة. امزج كل بئر جيدا باستخدام ماصة صغيرة.

بعد ترك جميع الألواح المحملة تحتضن لمدة أربع ساعات ، تحقق من حالة الخلايا تحت المجهر. بعد أربع ساعات ، يجب لصق معظم الخلايا على اللوحة إذا لزم الأمر. على الأكثر.

ستوفر ساعة أخرى من الحضانة ما يكفي من العمل بئر واحد في كل مرة. استنشق وسط التعدي من الخلايا الملتصقة واستبدله بحجم متساو من وسط الزراعة الدافئ. احرص على تجنب فصل الخلايا أثناء هذه الخطوة.

الآن ، احتضان الخلايا طالما دعت الحاجة. إذا لزم الأمر ، استبدل الوسائط كل 48 ساعة لتطبيق العلاجات بحيث تنتهي عندما يكون الحمض النووي أو الحمض النووي الريبي المنقول في ذروة تأثيره. عند معالجة الخلايا بالمؤثرات ، استخدم وسيطا خاليا من المصل بدون PMA وبدون بيتا ميركابتو إيثانول.

احرص على عدم ترك الخلايا تحتضن لأكثر من 24 ساعة بدون مصل. تم استخدام البروتوكول للنقل ، وتم تقييم THP واحد ضامة مع مورفولوجيا خلوية IRNA. وفقا لقياس التدفق الخلوي.

كان معدل موت الخلايا المبرمج والنخر في الخلايا منخفضا في كل من الثقافات المنقولة والثقافية الضابطة. ومع ذلك ، كشفت الحسابات الدقيقة أن كلا من موت الخلايا المبرمج والنخر كانا أعلى قليلا بالنسبة للعينات المنقولة. قد يكون هذا بسبب أن البلاعم المنقولة THP واحدة كانت أكثر صعوبة في فصلها عن الصفائح من الخلايا المنقولة UNT.

بشكل عام ، كانت معدلات التعدي أعلى من 90٪ كما تم تحليلها بواسطة قياس التدفق الخلوي. كما تم تأكيد استخدام كفاءة التعداء الفلورية S-I-R-N-A بواسطة الفحص المجهري الفلوري. تم عرض وظيفة التعدي من خلال ضربة قاضية جينية لتعبير IL 10 RB.

استخدام الحمض النووي الريبي المتداخل القصير بمجرد إتقانه ، يمكن إجراء الترانسفيكت في غضون ساعة إلى ساعة ونصف إذا تم إجراؤه بشكل صحيح. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر أن وسيط الثقافة له تأثير كبير على الأداء. هذا موضح في بروتوكول النص.