والتجريبية وبروتوكول المعلوماتية الحيوية لتحليل-RNA وما يليها من دور التعرض للضوء الكمون في النمر الآسيوي البعوض، بحمى الضنك
November 30th, 2014
RNA-Seq ذات أهمية متزايدة لتحديد الأسس الجزيئية للسمات التكيفية في الكائنات الحية غير النموذجية. هنا ، يتم وصف بروتوكول لتحديد الجينات المعبر عنها بشكل تفاضلي بين بعوض الزاعجة الزاعجة غير المصابة بالسبات وغير السبتة ، من تربية البعوض ، إلى تسلسل الحمض النووي الريبي وتحليلات المعلوماتية الحيوية لبيانات RNA-Seq.
الهدف العام من التجربة التالية هو تحديد مكونات النسخ لاستجابة السبات الدورية للصور. في صورة الكوع غير النموذجية للبعوض في الثمانينيات ، يتم تحقيق ذلك عن طريق إنتاج عينات مكررة بيولوجيا أولا من بيض السبات وغير السبات عبر علاجات دورية مختلفة للصور. كخطوة ثانية ، يتم استخراج الحمض النووي الريبي من كل تكرار لتسلسل الحمض النووي الريبي عالي الإنتاجية.
ثم تتم معالجة تسلسلات الحمض النووي الريبي حسابيا لتجميعها في congs والتعليق عليها. في النهاية ، يمكن استنتاج الاختلافات في التعبير الجيني استجابة لفترات التصوير التي تحفز السبات مقابل فترات الصورة التي تسبب عدم التوقف من Reeds MAP إلى تجميع الحمض النووي الريبي. الميزة الرئيسية لهذه التقنية على الطرق الحالية ، مثل تحليل الأشعة الدقيقة ، هي أن الموارد الوراثية السابقة مثل تسلسل الجينوم أو المصفوفة الدقيقة ، ليست مطلوبة للحصول على تقديرات عالمية للتعبير الجيني استجابة لظروف السبات.
يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال علم الجينوم البيئي ، مثل ما هو أساس النسخ ل DPOs أو التكيفات البيئية الرئيسية الأخرى في الكائنات الحية غير النموذجية. بشكل عام ، سيكافح الأفراد الجدد في هذه الطريقة حيث قد يكون من الصعب الحصول على كميات كافية من بيض السبات وغير DPOs ، وقد يكون تحليل المعلوماتية الحيوية النهائية أمرا صعبا. خطرت لنا فكرة هذه الطريقة لأول مرة عندما لاحظنا أن تقنيات تسلسل الحمض النووي عالية الإنتاجية أصبحت ميسورة التكلفة وقدمت طريقة قابلة للتتبع للحصول على ملفات تعريف تعبير الجينوم الكامل في الكائنات الحية غير النموذجية قبل بدء الإجراء.
قم بتعيين خزانتين لفترة الصور مع إضاءة قابلة للبرمجة عند 21 درجة مئوية للحصول على تعبير مثالي عن السبات وحوالي 80٪ من الرطوبة النسبية قم ببرمجة خزانة واحدة لفترة تصوير غير مسببة للسبات مع دورة داكنة فاتحة 16 وثماني فاتحة والأخرى لمرض السبات الذي يؤدي إلى ثماني 16 دورة مظلمة فاتحة مع إضاءة الأضواء في نفس الوقت لكلتا الخزانتين لمزامنة الوقت اليومي بين فترات الصورة. بعد ذلك ، اغمر أوراق البيض للحصول على عدد مناسب من البيض في 500 مل من الماء منزوع الأيونات وأضف ملليلترا واحدا من طعام المطحون وملاط طعام الروبيان المالح. قم بتغطية الحاوية بشبكة وضع شريط مطاطي حول الشبكة لإبقائها في مكانها.
ثم احتضن البيض في خزانة فترة الصور الطويلة الداكنة البالغ عددها 16 ثمانية لمدة 24 ساعة تقريبا. في اليوم التالي ، انقل حوالي 30 يرقة مفرغة لكل مجموعة إلى أطباق بتري فردية 10 × 10 × سنتيمترين مملوءة ب 90 مل من الماء منزوع الأيونات. كل 48 إلى 72 ساعة ، انقل اليرقات إلى طبق نظيف ، وقم بإطعامها بملاط الطعام الطازج في كل عملية نقل.
بعد حوالي ستة أيام ، قم بتبطين الجزء السفلي من ثلاثة إلى أربعة أقفاص للبالغين لكل علاج لفترة الصورة بورق ترشيح مبلل وبلل ورق الترشيح بما يكفي من الماء منزوع الأيونات لزيادة الرطوبة المحلية في القفص مع تجنب المياه الراكدة. لاحظ فترة الصورة ، وتاريخ بدء قفص الأرقام المتكرر ، والمعلومات الأخرى ذات الصلة بالتجربة باستخدام علامة دائمة على جانب القفص. ثم كل يومين لمدة 10 أيام ، انقل البوي إلى أكواب صغيرة من الماء النظيف بما لا يزيد عن 50 بوي لكل 25 مل من الماء إلى أقفاص البالغين المناسبة للتجربة ووضع الزبيب العضوي على الشبكة العلوية للقفص لتوفير السكر للبالغين الناشحين لتحفيز وضع البويضات بعد أربعة إلى خمسة أيام من وجبة الدم الأولى ، املأ أكواب داكنة اللون سعة 50 مليلتر مبطنة بمنشفة ورقية غير مبيضة في منتصف الطريق بالماء منزوع الأيونات وضع كوبا واحدا في كل قفص لجمع البيض وتخزينه.
استبدل أوراق البيض في كل قفص بورق جديد ، ووضع الأوراق التي تمت إزالتها مؤخرا في أطباق بتري وتخزينها في خزانة فترة الصور الثمانية ذات 16 ساعة داكنة فاتحة لتجنب التأثيرات المربكة على تخزين البيض. بعد حوالي 48 ساعة من الجمع ، جفف أوراق البيض في الهواء الطلق بحيث تكون ضعيفة ورطبة قليلا عند لمسها ، ولكن ليست رطبة لدرجة أن الأوراق مظلمة من الماء أو تحفز الفقس. لقياس حوادث السبات ، سجل عدد البيض على كل ورقة بيضة.
ثم اغمر الأوراق الفردية تماما في طبق بتري سعة 90 مليلتر مع ما يقرب من 80 مل من الماء منزوع الأيونات. لتحفيز فقسها ، أضف ما يقرب من 0.25 مل من ملاط الطعام ، ثم بعد 24 ساعة ، انقل طبق بتري إلى سطح أسود. الآن ضع مصدر ضوء على جانب واحد من اليرقات ، وسوف تبتعد اليرقات عن الضوء ، مما يسمح بإحصاء واضح للفرد الأول في يرقات النجوم.
استخدم ماصة لإزالة كل يرقات بعد العد لمنع إعادة عد الأفراد. ثم ضع أوراق البيض في طبق بتري جديد حتى يجف باللون الأحمر. بعد عد الدفعة الثانية من الصغار بعد أسبوع ، ضع أوراق البيض مع البيض المتبقي غير المفرغ في أطباق بتري جديدة سعة 90 مليلتر مع ما يقرب من 80 مل من محلول التبييض الطازج مع الحرص على غمر الأوراق بالكامل في محلول التبييض.
اترك الأوراق تحت غطاء الدخان طوال الليل ثم استخدم في اليوم التالي مجهرا ضوئيا لحساب عدد البيض غير المفرغ. إذا تم تجنيب البويضة ، فستظهر لونا أبيض فاتح مع ظهور العينين على شكل نقطتين أسودين صغيرتين مقابل بعضهما البعض على الجانب الظهري. للبدء ، قم بتنظيف المقعد بعناية بمحلول إزالة تلوث الحمض النووي الريبي لإزالة أي نوكليازات متبقية ولتجنب تدهور الحمض النووي الريبي.
بعد ذلك ، استخدم فرشاة شعر الإبل لتنظيف ما لا يقل عن 400 بيضة بعوض تحتوي على أجنة نامية في وقت النمو. نقطة اهتمام في المطاحن الزجاجية. في غطاء الدخان ، أضف ملليلترا واحدا من التريول وطحن البيض حتى يتم سحقه تماما ، ثم قم بإجراء استخراج الحمض النووي الريبي في التريول ، متبوعا بترسيب الأيزوبروبانول وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
استخدم الآن ما يصل إلى ميكرولتر واحد من D ns لكل ما يصل إلى 10 ميكروغرام من الحمض النووي الريبي في 50 ميكرولترا من التفاعل لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. بعد ذلك ، احتضان التفاعل في خمسة ميكرولترات من كاشف تعطيل الحمض النووي المعلق لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. قم بتدوير التعليق برفق ثلاث مرات خلال فترة الحضانة.
ثم الطرد المركزي لمستخلصات الحمض النووي الريبي لمدة 1.5 دقيقة عند 10،000 مرة G و Eloqua ، الحمض النووي الريبي الذي يحتوي على مواد طافية في أنابيب جديدة للتسلسل. أخيرا ، راجع النص المصاحب للحصول على تفاصيل حول كيفية معالجة بيانات تسلسل الجيل التالي الناتجة من القراءة والتحضير والتجميع والتعليق التوضيحي إلى تحليل التعبير التفاضلي. في هذا الشكل الأول ، يظهر القياس الفلوري لعينتين تمثيليتين من الحمض النووي الريبي شريطين عند حوالي 2000 نيوكليوتيد.
يتكون الحمض النووي الريبي الريبوزومي للحشرة 28 s من سلسلتين عديد النوكليوتيدات مرتبطتين معا بواسطة روابط هيدروجينية تتعطل بسهولة عن طريق التسخين القصير أو العوامل التي تكسر الروابط الهيدروجينية. المكونان الناتجان هما تقريبا نفس حجم الحمض النووي الريبي الريبوزومي 18 ثانية في عينة الحمض النووي الريبي الثانية ، ويمكن ملاحظة مستويات عالية من التحلل في هذه التجربة التمثيلية. أدى العلاج الدوري المصور لمجموعة تمثيلية من بعوض ألبوبيكتوس إلى حوادث عالية في البعوض الذي يتم تربيته في اليوم القصير وحوادث سبات منخفضة في البعوض الذي يتم تربيته في النهار الطويل.
على الرغم من وجود بعض الاختلاف بين التكرارات ، على سبيل المثال ، أظهرت المجموعة القصيرة الثانية حوادث سبات أقل من التكرارات الأخرى. نتج عن تجميع الثالوث للقراءات الطبيعية رقميا 76،377 contigs بمتوسط طول conig يبلغ 1020 3.1 وأقصى طول Conti يبلغ 20،892. لاحظ أن توزيع أطوال Conti يميل بشدة نحو contigs أقصر.
هذا هو الحال بالنسبة لتجميع نسخ Denovo. في هذا الرسم البياني النهائي ، تكشف تحليلات التعبير التفاضلي من سير عمل مماثل للأجنة التي تمت تربيتها في ظل ظروف مسببة للسبات في 11 و 21 يوما بعد وضع البويضات عن 3،128 جينا معبر عنه تفاضليا بين هاتين الفترتين الزمنيتين. بمجرد إتقانها ، يمكن إكمال هذه التقنية في غضون ستة إلى ثمانية أشهر من تحليل المعلوماتية الإلهية لتوليد الأنسجة إذا تم إجراؤها بشكل صحيح.
أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر أنه يجب التحقق من النجاح في كل خطوة قبل الانتقال إلى الخطوة التالية. على سبيل المثال ، تأكد من أن الظروف التجريبية قد أنتجت DPAs وبويضات غير سباتية قبل اختبار سلامة الحمض النووي الريبي باتباع هذا الإجراء. يمكن إجراء طرق أخرى مثل R-T-P-C-R الكمي أو تحليل الجينوم المقارن للإجابة على أسئلة إضافية تتعلق بالأنسجة أو التعبير المحدد للجينات ذات الأهمية و / أو عمليات التطور الجزيئي.
لا تنس أن العمل مع التريول يمكن أن يكون خطيرا للغاية وأنه يجب دائما اتخاذ الاحتياطات مثل استخدام القفازات ومعطف المختبر وغطاء الدخان أثناء تنفيذ هذا الإجراء.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
نظرة عامة
تقوم هذه الدراسة بعرض بروتوكول لتحديد الجينات التي يتم التعبير عنها بشكل مختلف في بعوضة Aedes albopictus أثناء حالات السكون واللا سكون. يتضمن النهج تربية البعوض تحت ظروف ضوئية مختلفة، متبوعًا باستخراج الحمض النووي الريبي وتسلسل عالي الإنتاجية لتحليل اختلافات التعبير الجيني.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- علم الأعصاب
- علم الجينوم
- علم البيئة
الخلفية
- السكون هو سمة تكيفية حاسمة في العديد من الكائنات الحية.
- Aedes albopictus هو كائن غير نموذجي ذو تأثير بيئي كبير.
- RNA-Seq هو أداة قوية لدراسة التعبير الجيني دون الحاجة إلى موارد جينية سابقة.
- يمكن أن يساعد فهم التعبير الجيني استجابة للإشارات البيئية في إغناء الدراسات البيئية والتطورية.
هدف الدراسة
- تحديد المكونات النسخية للاستجابة للسكون الدوري الضوئي.
- مقارنة التعبير الجيني بين حالات السكون واللا سكون.
- تعزيز فهم السمات التكيفية في الكائنات غير النموذجية.
الطرق المستخدمة
- تم إنتاج عينات مكررة بيولوجيًا من البيض في حالات السكون واللا سكون.
- تم استخراج الحمض النووي الريبي من كل مكرر للتسلسل.
- تم إجراء تسلسل عالي الإنتاجية للحمض النووي الريبي.
- تم استخدام المعالجة الحسابية لتجميع وتعليق تسلسل الحمض النووي الريبي.
النتائج الرئيسية
- تم تحديد اختلافات في التعبير الجيني استجابة لظروف ضوئية مختلفة.
- أظهرت الدراسة فعالية RNA-Seq في الكائنات غير النموذجية.
- اكتسبت رؤى حول الآليات الجزيئية الكامنة وراء السكون.
- قد تثري النتائج البحوث المستقبلية حول السمات التكيفية في أنواع أخرى.
الاستنتاجات
- RNA-Seq طريقة قيّمة لدراسة التعبير الجيني في الكائنات غير النموذجية.
- تساهم النتائج في فهم السمات التكيفية المتعلقة بالتغيرات البيئية.
- يمكن تطبيق هذا النهج على أنواع أخرى تواجه تحديات بيئية مماثلة.
الأسئلة المتداولة
Executive Industry Relevance
This protocol enables target validation in non-model organisms by linking environmental cues to transcriptional responses, supporting mechanistic de-risking in early discovery. It provides a scalable approach for phenotypic screening of adaptive traits without requiring prior genomic resources, reducing dependency on model systems. The workflow supports predictive confidence in target identification by isolating photoperiod as an independent variable and measuring gene expression as a quantitative dependent variable.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of transcriptional responses to environmental stimuli for target hypothesis testing.
- Operational Value: Supports biological de-risking by identifying genes differentially expressed in diapause versus non-diapause states.
- Predictive Value: Facilitates portfolio triage by linking photoperiodic treatment to measurable transcriptional outputs.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Produces validated biological systems (diapause and non-diapause eggs) for downstream compound screening.
- Operational Value: Standardizes sample preparation and RNA extraction for reproducible high-throughput sequencing.
- Scalability: Enables platform reuse across mosquito species and life history traits with modest protocol adjustments.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Connects discovery-phase gene expression findings to phenotypic outcomes like developmental arrest and metabolic suppression.
- Mechanistic De-risking: Identifies transcriptional networks underlying diapause, informing biomarker selection for preclinical validation.
- Risk-Adjusted Advancement: Supports go/no-go decisions by providing quantitative thresholds for differential expression (e.g., 3,128 DEGs across timepoints).
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from hypothesis testing to lead identification, particularly for targets involved in environmental sensing and stress response pathways.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by isolating photoperiod as an independent variable and measuring transcriptional changes as dependent variables.
- Screening: Enables assay readiness through standardized rearing, diapause induction, and RNA quality control steps.
- Analytics: Generates quantitative gene expression measurements (e.g., contig assembly, differential expression) that allow cross-condition comparison.
- Translational Research: Links transcriptional changes to phenotypic diapause outcomes, supporting biomarker alignment in preclinical models.
- Enterprise Reuse: The workflow is adaptable to other mosquitoes and ecological traits, promoting platform-level investment over single-use assays.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity in environmental response pathways.
- Operational Value: Enhances reproducibility through biologically replicated samples and standardized RNA extraction protocols.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling screening in non-model organisms without prior genome investment.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by providing transcriptional evidence for target advancement.
Implementation Considerations
- Requires expertise in mosquito rearing, photoperiod control, and RNA handling under RNase-free conditions.
- Depends on access to Illumina sequencers and computational infrastructure for de novo transcriptome assembly and annotation.
- Necessitates cross-team standardization between entomology, molecular biology, and bioinformatics groups.
- Requires adaptation of diapause induction conditions (e.g., light:dark cycles, temperature) for different species or strains.
- Practical limitations include the time-intensive nature of diapause induction (6–8 months) and challenges in obtaining sufficient diapause egg yields.
