والتجريبية وبروتوكول المعلوماتية الحيوية لتحليل-RNA وما يليها من دور التعرض للضوء الكمون في النمر الآسيوي البعوض، بحمى الضنك

الهدف العام من التجربة التالية هو تحديد مكونات النسخ لاستجابة السبات الدورية للصور. في صورة الكوع غير النموذجية للبعوض في الثمانينيات ، يتم تحقيق ذلك عن طريق إنتاج عينات مكررة بيولوجيا أولا من بيض السبات وغير السبات عبر علاجات دورية مختلفة للصور. كخطوة ثانية ، يتم استخراج الحمض النووي الريبي من كل تكرار لتسلسل الحمض النووي الريبي عالي الإنتاجية.

ثم تتم معالجة تسلسلات الحمض النووي الريبي حسابيا لتجميعها في congs والتعليق عليها. في النهاية ، يمكن استنتاج الاختلافات في التعبير الجيني استجابة لفترات التصوير التي تحفز السبات مقابل فترات الصورة التي تسبب عدم التوقف من Reeds MAP إلى تجميع الحمض النووي الريبي. الميزة الرئيسية لهذه التقنية على الطرق الحالية ، مثل تحليل الأشعة الدقيقة ، هي أن الموارد الوراثية السابقة مثل تسلسل الجينوم أو المصفوفة الدقيقة ، ليست مطلوبة للحصول على تقديرات عالمية للتعبير الجيني استجابة لظروف السبات.

يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال علم الجينوم البيئي ، مثل ما هو أساس النسخ ل DPOs أو التكيفات البيئية الرئيسية الأخرى في الكائنات الحية غير النموذجية. بشكل عام ، سيكافح الأفراد الجدد في هذه الطريقة حيث قد يكون من الصعب الحصول على كميات كافية من بيض السبات وغير DPOs ، وقد يكون تحليل المعلوماتية الحيوية النهائية أمرا صعبا. خطرت لنا فكرة هذه الطريقة لأول مرة عندما لاحظنا أن تقنيات تسلسل الحمض النووي عالية الإنتاجية أصبحت ميسورة التكلفة وقدمت طريقة قابلة للتتبع للحصول على ملفات تعريف تعبير الجينوم الكامل في الكائنات الحية غير النموذجية قبل بدء الإجراء.

قم بتعيين خزانتين لفترة الصور مع إضاءة قابلة للبرمجة عند 21 درجة مئوية للحصول على تعبير مثالي عن السبات وحوالي 80٪ من الرطوبة النسبية قم ببرمجة خزانة واحدة لفترة تصوير غير مسببة للسبات مع دورة داكنة فاتحة 16 وثماني فاتحة والأخرى لمرض السبات الذي يؤدي إلى ثماني 16 دورة مظلمة فاتحة مع إضاءة الأضواء في نفس الوقت لكلتا الخزانتين لمزامنة الوقت اليومي بين فترات الصورة. بعد ذلك ، اغمر أوراق البيض للحصول على عدد مناسب من البيض في 500 مل من الماء منزوع الأيونات وأضف ملليلترا واحدا من طعام المطحون وملاط طعام الروبيان المالح. قم بتغطية الحاوية بشبكة وضع شريط مطاطي حول الشبكة لإبقائها في مكانها.

ثم احتضن البيض في خزانة فترة الصور الطويلة الداكنة البالغ عددها 16 ثمانية لمدة 24 ساعة تقريبا. في اليوم التالي ، انقل حوالي 30 يرقة مفرغة لكل مجموعة إلى أطباق بتري فردية 10 × 10 × سنتيمترين مملوءة ب 90 مل من الماء منزوع الأيونات. كل 48 إلى 72 ساعة ، انقل اليرقات إلى طبق نظيف ، وقم بإطعامها بملاط الطعام الطازج في كل عملية نقل.

بعد حوالي ستة أيام ، قم بتبطين الجزء السفلي من ثلاثة إلى أربعة أقفاص للبالغين لكل علاج لفترة الصورة بورق ترشيح مبلل وبلل ورق الترشيح بما يكفي من الماء منزوع الأيونات لزيادة الرطوبة المحلية في القفص مع تجنب المياه الراكدة. لاحظ فترة الصورة ، وتاريخ بدء قفص الأرقام المتكرر ، والمعلومات الأخرى ذات الصلة بالتجربة باستخدام علامة دائمة على جانب القفص. ثم كل يومين لمدة 10 أيام ، انقل البوي إلى أكواب صغيرة من الماء النظيف بما لا يزيد عن 50 بوي لكل 25 مل من الماء إلى أقفاص البالغين المناسبة للتجربة ووضع الزبيب العضوي على الشبكة العلوية للقفص لتوفير السكر للبالغين الناشحين لتحفيز وضع البويضات بعد أربعة إلى خمسة أيام من وجبة الدم الأولى ، املأ أكواب داكنة اللون سعة 50 مليلتر مبطنة بمنشفة ورقية غير مبيضة في منتصف الطريق بالماء منزوع الأيونات وضع كوبا واحدا في كل قفص لجمع البيض وتخزينه.

استبدل أوراق البيض في كل قفص بورق جديد ، ووضع الأوراق التي تمت إزالتها مؤخرا في أطباق بتري وتخزينها في خزانة فترة الصور الثمانية ذات 16 ساعة داكنة فاتحة لتجنب التأثيرات المربكة على تخزين البيض. بعد حوالي 48 ساعة من الجمع ، جفف أوراق البيض في الهواء الطلق بحيث تكون ضعيفة ورطبة قليلا عند لمسها ، ولكن ليست رطبة لدرجة أن الأوراق مظلمة من الماء أو تحفز الفقس. لقياس حوادث السبات ، سجل عدد البيض على كل ورقة بيضة.

ثم اغمر الأوراق الفردية تماما في طبق بتري سعة 90 مليلتر مع ما يقرب من 80 مل من الماء منزوع الأيونات. لتحفيز فقسها ، أضف ما يقرب من 0.25 مل من ملاط الطعام ، ثم بعد 24 ساعة ، انقل طبق بتري إلى سطح أسود. الآن ضع مصدر ضوء على جانب واحد من اليرقات ، وسوف تبتعد اليرقات عن الضوء ، مما يسمح بإحصاء واضح للفرد الأول في يرقات النجوم.

استخدم ماصة لإزالة كل يرقات بعد العد لمنع إعادة عد الأفراد. ثم ضع أوراق البيض في طبق بتري جديد حتى يجف باللون الأحمر. بعد عد الدفعة الثانية من الصغار بعد أسبوع ، ضع أوراق البيض مع البيض المتبقي غير المفرغ في أطباق بتري جديدة سعة 90 مليلتر مع ما يقرب من 80 مل من محلول التبييض الطازج مع الحرص على غمر الأوراق بالكامل في محلول التبييض.

اترك الأوراق تحت غطاء الدخان طوال الليل ثم استخدم في اليوم التالي مجهرا ضوئيا لحساب عدد البيض غير المفرغ. إذا تم تجنيب البويضة ، فستظهر لونا أبيض فاتح مع ظهور العينين على شكل نقطتين أسودين صغيرتين مقابل بعضهما البعض على الجانب الظهري. للبدء ، قم بتنظيف المقعد بعناية بمحلول إزالة تلوث الحمض النووي الريبي لإزالة أي نوكليازات متبقية ولتجنب تدهور الحمض النووي الريبي.

بعد ذلك ، استخدم فرشاة شعر الإبل لتنظيف ما لا يقل عن 400 بيضة بعوض تحتوي على أجنة نامية في وقت النمو. نقطة اهتمام في المطاحن الزجاجية. في غطاء الدخان ، أضف ملليلترا واحدا من التريول وطحن البيض حتى يتم سحقه تماما ، ثم قم بإجراء استخراج الحمض النووي الريبي في التريول ، متبوعا بترسيب الأيزوبروبانول وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.

استخدم الآن ما يصل إلى ميكرولتر واحد من D ns لكل ما يصل إلى 10 ميكروغرام من الحمض النووي الريبي في 50 ميكرولترا من التفاعل لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. بعد ذلك ، احتضان التفاعل في خمسة ميكرولترات من كاشف تعطيل الحمض النووي المعلق لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. قم بتدوير التعليق برفق ثلاث مرات خلال فترة الحضانة.

ثم الطرد المركزي لمستخلصات الحمض النووي الريبي لمدة 1.5 دقيقة عند 10،000 مرة G و Eloqua ، الحمض النووي الريبي الذي يحتوي على مواد طافية في أنابيب جديدة للتسلسل. أخيرا ، راجع النص المصاحب للحصول على تفاصيل حول كيفية معالجة بيانات تسلسل الجيل التالي الناتجة من القراءة والتحضير والتجميع والتعليق التوضيحي إلى تحليل التعبير التفاضلي. في هذا الشكل الأول ، يظهر القياس الفلوري لعينتين تمثيليتين من الحمض النووي الريبي شريطين عند حوالي 2000 نيوكليوتيد.

يتكون الحمض النووي الريبي الريبوزومي للحشرة 28 s من سلسلتين عديد النوكليوتيدات مرتبطتين معا بواسطة روابط هيدروجينية تتعطل بسهولة عن طريق التسخين القصير أو العوامل التي تكسر الروابط الهيدروجينية. المكونان الناتجان هما تقريبا نفس حجم الحمض النووي الريبي الريبوزومي 18 ثانية في عينة الحمض النووي الريبي الثانية ، ويمكن ملاحظة مستويات عالية من التحلل في هذه التجربة التمثيلية. أدى العلاج الدوري المصور لمجموعة تمثيلية من بعوض ألبوبيكتوس إلى حوادث عالية في البعوض الذي يتم تربيته في اليوم القصير وحوادث سبات منخفضة في البعوض الذي يتم تربيته في النهار الطويل.

على الرغم من وجود بعض الاختلاف بين التكرارات ، على سبيل المثال ، أظهرت المجموعة القصيرة الثانية حوادث سبات أقل من التكرارات الأخرى. نتج عن تجميع الثالوث للقراءات الطبيعية رقميا 76،377 contigs بمتوسط طول conig يبلغ 1020 3.1 وأقصى طول Conti يبلغ 20،892. لاحظ أن توزيع أطوال Conti يميل بشدة نحو contigs أقصر.

هذا هو الحال بالنسبة لتجميع نسخ Denovo. في هذا الرسم البياني النهائي ، تكشف تحليلات التعبير التفاضلي من سير عمل مماثل للأجنة التي تمت تربيتها في ظل ظروف مسببة للسبات في 11 و 21 يوما بعد وضع البويضات عن 3،128 جينا معبر عنه تفاضليا بين هاتين الفترتين الزمنيتين. بمجرد إتقانها ، يمكن إكمال هذه التقنية في غضون ستة إلى ثمانية أشهر من تحليل المعلوماتية الإلهية لتوليد الأنسجة إذا تم إجراؤها بشكل صحيح.

أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر أنه يجب التحقق من النجاح في كل خطوة قبل الانتقال إلى الخطوة التالية. على سبيل المثال ، تأكد من أن الظروف التجريبية قد أنتجت DPAs وبويضات غير سباتية قبل اختبار سلامة الحمض النووي الريبي باتباع هذا الإجراء. يمكن إجراء طرق أخرى مثل R-T-P-C-R الكمي أو تحليل الجينوم المقارن للإجابة على أسئلة إضافية تتعلق بالأنسجة أو التعبير المحدد للجينات ذات الأهمية و / أو عمليات التطور الجزيئي.

لا تنس أن العمل مع التريول يمكن أن يكون خطيرا للغاية وأنه يجب دائما اتخاذ الاحتياطات مثل استخدام القفازات ومعطف المختبر وغطاء الدخان أثناء تنفيذ هذا الإجراء.