تحليل الهجرة خلية داخل الكولاجين مصفوفة ثلاثية الأبعاد

الهدف العام من هذا الإجراء هو تحليل السلوك المهاجر للخلايا داخل البيئة ثلاثية الأبعاد. أولا ، قم بتضمين الخلايا ذات الأهمية في شبكة كولاجين ثلاثية الأبعاد. ثم قم بتسجيل حركة الخلايا عن طريق الفحص المجهري بالفيديو بفاصل زمني بعد ذلك ، وحدد معلمات الترحيل عن طريق تتبع الخلايا بمساعدة الكمبيوتر وتحليل بيانات تتبع الخلية باستخدام تطبيق برنامج جدول بيانات.

في النهاية ، يمكن استخدام هذه الطريقة للتحقيق في العوامل ومسارات نقل الإشارات التي تنظم هجرة الخلايا السرطانية أو الخلايا الطبيعية مثل الكريات البيض والخلايا الليمفاوية والخلايا الجذعية في سياق السرطان. لذا فإن معرفة هجرة الخلايا وعوامل التعديل ومسارات نقل الإشارات المرتبطة بها قد تكون مفيدة في تطوير استراتيجيات علاجية جديدة لإضعاف هجرة الخلايا السرطانية والانتشار النقيلي. بالنسبة لغرف الهجرة ، قم بتنظيف طبقتين من شمع البارافين المذاب بسرعة ، ومزيج الفازلين إلى منتصف شريحة زجاجية ، وأضف غطاءا ، وانزلق وختمها بطبقتين من شمع البارافين ، مزيج الفازلين.

ثم ضع غرف الهجرة في وضع رأسي في رف إلى أنابيب تفاعل سعة 1.5 ملليلتر. أضف 20 ميكرولترا من تعليق الخلية لتعليق الكولاجين. امزج 50 ميكرولترا من 10 XMEM و 27 ميكرولترا من محلول بيكربونات الصوديوم 7.5٪ يمزج جيدا.

ثم أضف 375 ميكرولترا من معلق الكولاجين السائل واخلطه جيدا للحصول على لون أرجواني فاتح يشير إلى درجة حموضة 7.5. أضف الآن 100 ميكرولتر من معلق الكولاجين النهائي إلى 50 ميكرولترا من تعليق الخلية واخلطه جيدا مع ملاحظة بدء ألياف الكولاجين. البلمره. عند درجة الحموضة 7.5 ، انقل المزيج إلى غرف الهجرة.

اضغط برفق على حجرة الهجرة لتوزيع مزيج خلايا تعليق الكولاجين بالتساوي في الجزء السفلي من حجرة سلسلة الهجرة. ضع غرف الهجرة في وضع رأسي في الرف واحتضنها لمدة 30 دقيقة. عندما تكون شبكة الكولاجين المبلمرة عكرة قليلا ، ولكنها لا تزال ذات لون أرجواني فاتح ، املأ غرف الهجرة بالوسط المناسب وأغلق غرفة الهجرة بشمع البارافين.

مزيج الفازلين. اضبط سخان مرحلة المجهر على 37 درجة مئوية باستخدام تكبير 10 × على غرفة الهجرة. ركز ما يقرب من 50 خلية أو أكثر في مجال الرؤية.

سجل هجرة الخلية في وضع الفاصل الزمني باستخدام تطبيق برمجي للمراقبة بالفيديو متعدد الكاميرات. احفظ أفلام ترحيل الخلايا بتنسيق ملف مناسب. اربط ملفات أفلام ترحيل الخلية بقاعدة بيانات تحتوي على معلومات داعمة مثل نوع الخلية والظروف التجريبية.

بعد ذلك ، قم بتحليل أفلام ترحيل الخلايا باستخدام تطبيق برمجي مناسب لتتبع الخلايا لإجراء تحليل غير متحيز. حدد الخلايا بشكل عشوائي لتحليلها دون معرفة ما إذا كانت الخلايا نشطة بشكل عام ، وحدد حوالي 60 إحداثيات XY لكل خلية في تجربة هجرة الخلايا النموذجية. في حالة انقسام الخلية ، اختر بشكل عشوائي خلية ابنة واحدة لمتابعتها في التتبع.

قم بتحليل بيانات تتبع الخلايا باستخدام تطبيق برمجي مناسب مثل برنامج جداول البيانات لحساب المسافة الإجمالية التي نقلتها الخلية. اضرب مجموع قيم البكسل العددية في عامل تصحيح للتحويل إلى ميكرونات. حدد الخلايا التي انتقلت أقل من عتبة 25 ميكرون كخلايا غير متحركة، واستبدل القيم الرقمية بفاصلة.

بعد ذلك ، احسب النشاط الحركي كنسبة مئوية من خلايا الخلايا المتعقبة التي انتقلت بين نقطتين زمنيتين. أيضا ، احسب وقت الحركة النشطة كنسبة مئوية من إجمالي الوقت الذي انتقلت فيه الخلية فيما يتعلق بالإطار الزمني لفترة المراقبة. ثم احسب الدلالة الإحصائية باستخدام اختبار رجل ويتني يو واعرض بيانات ترحيل الخلايا.

يشبه ملف بيانات تتبع الخلية النموذجي جدولا حيث يمثل كل عمود خلية واحدة متعقبة. تحتوي الصفوف على المعلومات الموضعية حول حركة الخلية. بمرور الوقت ، يمكن تمييز سلوك القاطرة للخلايا بمتوسط النشاط الحركي لمجموعة الخلايا التي تم تحليلها وكذلك وقت الحركة النشطة.

يوضح هذا المثال أنشطة الهجرة ل 120 خلية من أربع تجارب مستقلة. يشير كل ماسة إلى أن الخلية قد انتقلت بين نقطتين زمنيتين على الأقل. تميز الخطوط الرمادية بين الخلايا المتحركة وغير المتحركة.

يمكن عرض معلمة نشاط القاطرة كمخطط XY أو مخطط صندوقي. لتصور ديناميكيات مجموعة الخلايا التي تم تحليلها ، يظهر الرسم البياني بشكل فعال الوقت النشط لتلك الخلايا نفسها. يشير هذا التحليل للسلوك المهاجر لخطوط خلايا سرطان الثدي MDA HER2 و M-D-A-N-E-O إلى أن كلا الخطين الخليين أظهرا نشاطا حركيا عفويا مماثلا.

كشفت المعلمة النشطة عن عدد أكبر قليلا من خلايا M-D-A-H-E-R التي تتحرك تلقائيا مقارنة بخلايا سرطان الثدي M-D-A-N-O. أدى التحفيز ب 100 نانوجرام لكل مليلتر من EGF إلى زيادة كبيرة في نشاط الهجرة ل MDA HER2 كما تم قياسه بعدد الخلايا المتحركة ووقت الحركة النشطة. ومن المثير للاهتمام ، أن خلايا M-D-A-N-E-O هاجرت استجابة لتحفيز EGF وأظهرت علاجا نشطا متغيرا بالوقت باستخدام مثبط الفوسفوليباز c gamma one uc 3 1 22 قلل من الهجرة التلقائية والناجمة عن EGF لكل من M-D-E-E-R TWO و MDAN.

خلايا تكافؤ فرص العمل. كشف تحليل المعلمة النشطة للوقت أن معالجة خلايا MDAN EEO باثنين من الميكرومولار U 7 3 1 2 2 أدت إلى انخفاض ملحوظ في النشاط الحركي ، ويعزى ذلك في المقام الأول إلى زيادة كمية الخلايا غير المتحركة. بمجرد إتقان هجرة الخلايا الليمفاوية والكريات البيض إلى أحرف الكولاجين ثلاثية الأبعاد ويمكن تسجيلها في حوالي ساعتين حيث يتم تسجيل الخلايا السرطانية بين عشية وضحاها.