طائرة واحدة ومنهج وحدة الإضاءة الجزئي الشعرية لالمجهر حقل واسع

الهدف العام من هذا الإجراء هو إجراء فحص مجهري للإضاءة أحادية المستوى باستخدام وحدة إثارة الألواح الخفيفة للمجاهر المقلوبة وتطبيقها على كرويات الخلايا ثلاثية الأبعاد. يتم تحقيق ذلك عن طريق استخدام ماصة أولا لنقل خلية كروية من بئر صفيحة ميكروتيتر إلى بئر ثان لاحتضانها بعد الغسيل. ثم يتم إدخال الكروية S إلى شعرية مستطيلة.

الخطوة الثانية هي تركيب وحدة إضاءة الألواح الخفيفة على اللوحة الأساسية لطاولة تحديد المواقع المجهرية المقلوبة. بعد ذلك ، يتم وضع الشعيرات الدموية التي تحتوي على الستيرويد في حامل عينة خاص للفحص المجهري. الخطوة الأخيرة هي ضبط المطابقة بين ورقة الضوء والمستوى البؤري للعدسة الموضوعية المجهرية في مسار الكشف.

في النهاية ، يمكن إجراء قياسات مضان ثلاثي الأبعاد عن طريق تغيير المستوى البؤري داخل كروي الخلية للحصول على معلومات عن الصور المفردة أو Zacks فيما يتعلق بامتاص الأدوية أو بنية الكروية S. الميزة الرئيسية لهذه التقنية على مجاهر الألواح الضوئية الحالية هي أنها فعالة من حيث التكلفة ومتعددة الاستخدامات للغاية لأنها تتكون من وحدة يمكن تكييفها مع المجهر الحالي وتوفر درجة كبيرة من الحرية للبحث. تمتد الآثار المترتبة على هذه التقنية إلى البحث عن الأدوية والعوامل المستخدمة في العلاج والتشخيص ، على وجه الخصوص ، لأن تكييف نظام الموائع الدقيقة يسمح بالتحقيق في العمليات السريعة في ظل ظروف التدفق.

الآن طريقة الإثارة هذه بالاقتران مع أي تقنية الكشف يمكن أن توفر نظرة ثاقبة لمنشطات الخلايا الحية بجرعات الإضاءة المنخفضة. يمكن أيضا تطبيقه على الأنظمة الحية الأخرى مثل أسماك سيبرو وأجنة الأرتيلا وكذلك عينات أنسجة CLE البصرية. للبدء ، أضف 50 ميكرولترا من 1.5 aeros ساخنة في وسط الاستزراع في كل بئر من صفيحة 96 بئر واتركها تتصلب لمدة ساعة إلى ساعتين.

ثم قم بزرع حوالي 150 MCF سبع خلايا لسرطان الثدي في كل بئر من إجمالي S 96 بئر لمدة خمسة إلى سبعة أيام ، يصل قطرها إلى حوالي 200 إلى 300 ميكرومتر في حاضنة عند 5٪ ثاني أكسيد الكربون و 37 درجة مئوية. بعد ذلك ، احتضان الستيرويدات الخلوية مع المضاد الحيوي أنثراسيكلين دوكسوروبيسين هيدروكلوريد لمدة ست ساعات بتركيز يتراوح بين اثنين من الميكرومولار وثمانية ميكرومولار في المزرعة. وسط بعد الحضانة ، اغسل الخلايا OID بمحلول ملح مزرعة أو متوسط أو إيرل قبل الفحص المجهري.

استخدم مجهرا مقلوبا وقم بتركيب الفحص المجهري للإضاءة أحادية المستوى أو وحدة إثارة SPM على اللوحة الأساسية لطاولة تحديد المواقع. جهز المجهر بعدسة موضوعية مكبرة 10 مرات أو 20 مرة ومرشح تمرير طويل مناسب في مسار الكشف عن المجهر. ثم قم بتركيب كاميرا متكاملة على منفذ الكشف بالمجهر.

استخدم شعاعا مجمعا متوازيا لليزر أو الصمام الثنائي ليزر بطول موجي إثارة يبلغ 470 نانومتر بشكل تفضيلي وقم بتطبيقه على وحدة الدوران. بعد ذلك ، قم بتدوير العدسة الأسطوانية بمقدار 90 درجة ، والتي تنقل ورقة الضوء إلى وضع رأسي لضبط محوري لخصر شعاع الورقة الضوئية. ضع الشعيرات الدموية التي تحتوي على سائل به صبغة فلورية في حامل العينة.

قم بتوصيل حامل العينة مع الشعيرات الدموية بطاولة تحديد المواقع في المجهر. قم بمحاذاة موضع الشعيرات الدموية بحيث يكون في المنتصف ويكون خصر شعاع الورقة الضوئية في بؤرة التركيز. اضبط خصر الشعاع عن طريق تغيير الوضع المحوري للعدسة الأسطوانية نفسها.

أعد العدسة للخلف بعد الضبط. ضع الستيرويد الخلية بشكل منفصل أو في مجموعات داخل الشعيرات الدموية الزجاجية المستطيلة بو سيليكات مع مقطع عرضي داخلي من 600 × 600 ميكرومتر وسمك جدار 120 ميكرومتر. لتحقيق ذلك ، خذ الشعيرات الدموية الفارغة في وضع مستقيم بالإبهام والإصبع الأوسط وأغلق الفتحة العلوية بالسبابة.

إحضار الفتحة السفلية بالقرب من الخلية الكروية في السبابة السائلة المحيطة بها من سائل الفتحة العلوي مع الستيرويد في. سيتم نقعها على الفور بواسطة قوى الشعيرات الدموية. اضبط موضع الكروي S داخل الشعيرات الدموية المملوءة بالجاذبية.

بدلا من ذلك، ضع الستيرويد على الشعيرات الدموية عن طريق سحب العينات. احرص على أن تكون فتحة طرف الماصة كبيرة بما يكفي لحجم الكروية S من ناحية ومن ناحية أخرى ، أقل أو مساوية في الحجم مع القطر الداخلي للشعرية. بعد ذلك ، ضع الشعيرات الدموية التي تحتوي على الكروية S في حامل عينة خاص من الفحص المجهري.

قم بتوصيل حامل العينة مع الشعيرات الدموية بجدول تحديد المواقع في المجهر وقم بمحاذاة موضع الستيرويد الخلية بحيث يكون متمركزا ومركزا. اضبط المطابقة بين ورقة الضوء والمستوى البؤري للعدسة الموضوعية المجهرية في مسار الكشف عن طريق ضبط موضع مرآة الانعكاس والعدسة الأسطوانية. املأ الشعيرات الدموية بمصل ربلة الساق الجنينية أو FCS لمدة 30 دقيقة لدعم الالتصاق الخلوي لاحقا لستيرويد الخلية بالسطح الزجاجي الداخلي.

دع طلاء FCS المتبقي في الشعيرات الدموية المستنفدة يجف لمدة 12 ساعة على الأقل بعد إدخال الستيرويد الخلوي إلى الشعيرات الدموية المطلية ب FCS. كما كان من قبل, ترك الشعيرات الدموية في الحاضنة لمدة ساعتين إلى أربع ساعات إضافية للتسبب في التصاق خلوي من الستيرويد. بعد ذلك ، قم بإعداد جزء flx من نظام الموائع الدقيقة بما في ذلك مصيدة الفقاعات.

استخدم مضخة تمعجية لملء flx الأنبوب بوسط مزرعة يحتوي على دواء أو عامل صبغة الفلورسنت. قم أولا بتثبيت الشعيرات الدموية الخالية من الفقاعات على أنبوب التدفق ثم قم بتثبيت الجانب الآخر من الشعيرات الدموية في أنبوب الصرف. اضبط درجة حرارة السائل للحمام المائي على القيمة المطلوبة.

ثم اضبط المضخة التمعجية على سرعة المضخة المطلوبة. اجمع السائل الذي تم ضخه في مستلم من خلال إعداد حلقة مفتوحة للحصول على البيانات وتحليلها. اضبط طاقة الليزر ووقت التكامل للحصول على الصورة.

قم بتعيين الزيادة لمكدس ZS على قيمة تتراوح بين خمسة و10 ميكرومترات، وهو أمر مفضل لتحليل البيانات ثلاثي الأبعاد. نظرا لأن سمك ورقة الضوء حوالي 10 ميكرومتر ، فانتقل إلى إجراء قياسات للصور المفردة أو Zacks عن طريق اختلاف المستوى البؤري داخل الستيرويد الخلية. يظهر فحص Zack للستيرويد MC المكون من سبع خلايا تم تحضنه مسبقا بثمانية ميكرومولار دوكسوروبيسين لمدة ست ساعات.

الصور معلومات مفصلة حول امتصاص الدوكسوروبيسين الخلوي وتوزيعه وتدهوره. المنتج داخل طبقة الخلية الخارجية لدوكسوروبيسين الفلورسنت الأحمر الستيرويدي موضعي بشكل أساسي في النواة ، بينما في مناطق الروبوت الداخلية ، يصبح الفلورسنت الأخضر المقدم من منتج التحلل مهيمنا في الغشاء الخلوي. يتم تصوير امتصاص عقار العلاج الكيميائي دوكسوروبيسين في الخلايا الأصلية لسرطان الثدي البشري S لطبقة خلية واحدة يتم اختيارها بواسطة spm.

عند تطبيق اثنين من الميكرومولار ووسط الاستزراع داخل نظام التدفق ، زاد التألق الأحمر والأخضر للدوكسوروبيسين ومنتج تحلله بشكل مستمر عند تطبيق اثنين من دوكسوروبيسين ميكرومولار في وسط الاستزراع داخل نظام التدفق ، ويزداد التألق الأحمر والأخضر للدوكسوروبيسين ومنتج تحلله باستمرار. بمجرد إتقانها ، لا يستغرق الأمر سوى بضع دقائق من تركيب وحدة إزالة الألواح الضوئية حتى تسجيل صور الفلورسنت للعينات ثلاثية الأبعاد. عند القياس وحالة التدفق ، من المهم للغاية التأكد من أن العينة تلتصق بالسطح الداخلي للشعيرات الدموية وتجنب وصول فقاعات الهواء إلى العينة مما قد يفصلها عن الشعيرات الدموية.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد للفحص المجهري لإضاءة الألواح الضوئية باستخدام الوحدة متعددة الاستخدامات القابلة للتكيف مع المجاهر المختلفة.