من السريع إلى التصوير الإسفار الجزيئية قانون إنتشار على أغشية الخلايا الحية في المجهر التجاري

الهدف العام من هذا الإجراء هو قياس قانون انتشار الدهون والبروتينات في أغشية الخلايا الحية للقيام بذلك. أولا ، تتم معايرة وظيفة انتشار نقطة المجهر عن طريق تصوير حبات الفلورسنت النانوية. بعد ذلك ، يتم تحضير النواقل القائمة على الجسيمات الشحمية ، بما في ذلك جزيء المورد أهمية الفلورية ، وإدخالها في الخلايا الحية إما عن طريق التعداء أو الدمج المباشر.

يتم إجراء التصوير السريع لغشاء بلازما الخلية الحية عن طريق الفحص المجهري الفلوري الانعكاس الداخلي الكلي. أخيرا ، يتم حساب دالة الارتباط ويتم استخراج قانون الانتشار الجزيئي بواسطة التركيب الغوسي. البيانات الناتجة.

تحديد طريقة حركة الدهون أو البروتين قيد الفحص. الميزة الرئيسية لهذه التقنية على الاسترداد الفلوري التقليدي بعد نهج التبييض الضوئي أو التحليل الطيفي الكلاسيكي لارتباط التألق أحادي النقطة هي أنها تسمح بقياس قانون الانتشار الجزيئي. نحن نعرف معرفة النظام.

أيضا على عكس منهجيات تتبع الجسيمات المفردة الكلاسيكية. هنا ، يتم قياس الإزاحة المولية دون الحاجة إلى استخراج مسارات الجسيمات. نتيجة لذلك ، يمكن استخدام هذا المعدن بسهولة مع جزيء مفترض وكثيف نسبيا ، على سبيل المثال ، بروتينات الفلورسنت المشفرة وراثيا.

بشكل عام ، يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على السؤال الرئيسي في مجال البيولوجيا الجزيئية الخلوية ، مثل كيف تنظم حركة البروتين أو الدهون بنية غشاء البلازما وسيتم توفير الإجابة على هذه الأسئلة والأسئلة ذات الصلة للجميع وباستخدام مجهر تجاري فقط ، سيتم تنفيذ عرض توضيحي للإجراء العام بواسطة zo ، طالب دكتوراه من المختبر. ابدأ هذا البروتوكول بمعايرة وظيفة انتشار النقاط لنظام التصوير. ابدأ بتخفيف 10 ميكرولترات من محلول حبة الفلورسنت في 90 ميكرولترا من الماء المقطر الذي تمت إضافته مسبقا إلى أنبوب طرد مركزي سعة 500 ميكرولتر.

قم بتقطيع المحلول لمدة 20 دقيقة في حمام تقديم الطعام في الساونا باستخدام مشرط ، وقم بقطع قطعة مربعة بحجم سنتيمتر واحد من جل الورد AGA بنسبة 3٪ وضعها في طبق بتري. ضع 10 ميكرولتر من محلول حبة الفلورسنت المخفف في الجزء العلوي من الجل. ثم باستخدام الملقط ، اقلب قطعة الجل في طبق بتري زجاجي بحجم سنتيمترين.

مرة أخرى ، باستخدام الملقط. اضغط لأسفل على قطعة الجل لتفريق القطرة. قم بتشغيل إعداد الاستحواذ التالي ، والذي يتكون من مجهر مضان انعكاس داخلي تجاري.

مجهزة بحاضنة وكاميرا E-M-C-C-D سريعة متصلة بجهاز كمبيوتر يعمل بمجموعة تطبيقات Li ، وبرامج الفلورسنت المتقدمة و / أو برامج الحصول على الصور Solis. ضع العينة في الحامل على مرحلة المجهر باستخدام القطعة I والضوء المنقول. ركز على حدود الجل.

ثم توسيط هلام على الهدف وضبط التركيز لبدء إجراء محاذاة الليزر في مجموعة تطبيقات Leica, برنامج الفلورسنت المتقدمة حدد المحاذاة التلقائية واتبع إجراء المحاذاة التلقائية. بعد محاذاة الليزر في برنامج اكتساب و أو Solis ، انقر فوق زر الإعدادات. ستفتح نافذة.

اضبط تعرض الكاميرا على 100 مللي ثانية ، واكتسبت EM على 1000 ، والتكرار على 100 ، وحدد خانة اختيار نقل الإطار. ثم انقر فوق نافذة الحفظ التلقائي وأدخل اسم التجربة. ابحث عن مجال رؤية به نقاط مفردة معزولة.

ركز على نقطة مضيئة ، والتي عادة ما تمثل رك حبة. ثم احصل على 100 إطار. كرر هذه الخطوة من خمس إلى ست مرات للحصول على صور لعدة نقاط فردية.

قم باستيراد السلسلة المكتسبة إلى برنامج معالجة البيانات مثل MATLAB ومتوسط المكدس في الوقت المناسب. ثم اعرض صورة متوسط الكثافة المقاسة. قم بتكبير بقعة فلورية صغيرة وساطعة وحدد المركز تقريبا على أنه ألمع بكسل في البقعة.

أخيرا ، حدد حجم منطقة الاهتمام التي تريد رسمها حول الجسيم ، عادة ميكرون واحد بجوار توزيع الكثافة المحدد مع دالة غاوسية. حدد الأمر gause fit. افحص البقايا التي تم الحصول عليها للتحقق من جودة الملاءمة.

أخيرا ، قم بمعايرة الكاميرا كما هو موضح في المستند المصاحب. بمجرد معايرة النظام ، حان الوقت لتسمية الخلايا للحصول على الصور. ابدأ في تحضير الجسيمات الشحمية المطلوبة لدمج الدهون عن طريق إذابة ملليغرام واحد من المنشطات ، ومليغرام واحد من D-O-T-A-P ومليغرام واحد من معدات الوقاية الشخصية ADO 4 88 لكل منهما في أنبوب طرد مركزي دقيق منفصل يحتوي على مليلتر واحد من الكلوروفورم.

بعد ذلك ، امزج 0.5 مل لكل من محاليل DOPE و D-O-T-A-P مع 25 ميكرولترا من محلول PPE ATO 4 88. ضع الأنبوب في مبخر طرد مركزي وابدأ الدوران عند 280 جراما. ابدأ تشغيل مضخة التفريغ واتركها تدور لمدة 24 ساعة.

في اليوم التالي ، أضف 0.5 مل من 20 ملليمولار عازلة إلى الأنبوب وقم بدوامته لمدة 15 دقيقة. ثم ضع الأنبوب في حمام تقديم الطعام الصوتي وصوتي لمدة 15 دقيقة عند 40 درجة مئوية. لتحضير الخلايا ، اغسل طبق P 100 من مبيض الهامستر الصيني المتقارب أو CHOK خلية واحدة ثلاث مرات مع 10 ملليلتر من PBS.

ثم أضف ملليلترا واحدا من التربسين واحتضنه عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة خمس دقائق. بعد الحضانة ، أضف تسعة ملليلتر من D-M-E-M-F 12 مكملا بنسبة 10٪ من FBS لتعليق الخلايا بذرة 150 ميكرولتر من هذه الخلية المحتوية على المحلول. في طبق بتري ذو قاع زجاجي مقاس 22 ملم يحتوي على 800 ميكرولتر من نفس الوسط.

احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة 24 ساعة. لدمج الدهون ، استبدل وسط الخلية ب 500 ميكرولتر من الوسط الخالي من المصل ، واحتضنه لمدة 30 دقيقة. بعد الحضانة ، أضف ميكرولترين من محلول الجسيم الشحمي واحتضنه لمدة 15 دقيقة أخرى.

ثم اغسل الخلايا باستخدام PBS وأضف DM EMF 12 جديدا. قبل التصوير قبل 12 ساعة على الأقل من التجربة ، قم بتشغيل حاضنة المجاهر لإحضار مرحلة المجهر والمكونات البصرية إلى درجة حرارة التجربة. أصعب خطوة في هذا الإجراء هي هذا الاستحواذ.

من أجل ضمان النجاح ، تأكد من تحسين كل معلمة اكتساب للنظام. قيد الدراسة. في يوم التجربة ، قم بتشغيل المجهر ، وانتظر حتى تصل الكاميرات إلى درجة حرارة العمل.

لإجراء التجربة ، سنستخدم كاميرتين. سيتم استخدام الكاميرا الأولى للتصوير وسيتم استخدام الكاميرا الثانية لتحديد الخلية. سيسمح هذا التكوين بأسرع وقت اكتساب يمكن تحقيقه في البرنامج.

لتعيين معلمات التصوير الضوئي المرسل. أدخل 20 مللي ثانية بالنسبة لوقت التعريض الضوئي، أدخل واحدة لكسب EM لكلتا الكاميرتين. ثم افتح نافذة وضع التباين في البرنامج وغادر.

انقر فوق BF لتحديد خيار الحقل الساطع. ضع العينات في الحامل أثناء عرض العينة من خلال قطع العين. اجعل العينة في بؤرة التركيز.

ثم أرسل الضوء يدويا إلى الكاميرا الأولى وادفع الشقوق برفق بحيث يضيء عائد الاستثمار المراد تصويره فقط. بعد ذلك ، انقل خلية إلى المنطقة المحددة وباستخدام البرنامج ، أرسل الضوء إلى الكاميرا الثانية. ثم في البرنامج ، ارسم عائد استثمار لإنشاء مرجع.

أولا ، لمحاذاة الليزر بواسطة البرنامج ، حدد المحاذاة التلقائية. ثم لبدء إجراء المحاذاة التلقائية، حدد تمكين الموازاة. ثم افتح الحاضنة في الأعلى وقم بموازاة شعاع الليزر.

عندما تتم محاذاة الليزر في الزاوية اليسرى السفلية من نافذة البرنامج اليسرى ، انقر فوق الزر 70 لضبط عمق الاختراق على 70 نانومتر. سيتوافق هذا مع زاوية سقوط الليزر على الزجاج السفلي حوالي 70 درجة في مجموعة تطبيقات Leica. مربع نص وقت التعرض لبرامج الفلورسنت المتقدمة.

أدخل 70 مللي ثانية في مربع نص كسب EM. أدخل 1000 لفعل الشيء نفسه على الكاميرا الثانية. افتح نافذة الإعدادات وأدخل نفس الأرقام في مربعات النص المقابلة.

انقر بعد ذلك على الزر المباشر. سيتم إرسال التألق إلى الكاميرا الأولى ، وستظهر صورة للعينة على الشاشة. حرك العينة حتى تصل خلية الفلورسنت إلى المنطقة المرجعية محل الاهتمام.

ثم اضغط على الزر الموجود في الجزء الأمامي من جسم المجهر لإرسال الضوء إلى الكاميرا الثانية وحرك عجلة موضع Z بدقة للتركيز على غشاء الخلية في البرنامج و / أو الوحيد. افتح نافذة الإعدادات واضبط الحد الأدنى لوقت التعريض الضوئي الذي يمكن تحقيقه 1000 EM وضع المستشعر المقطوع 10 إلى التكرار الخامس ، واضبط خيار الحفظ التلقائي لبدء الحصول على سلسلة الصور. انقر فوق رمز الكاميرا الخاص بالبرنامج وانتظر حتى ينتهي الاستحواذ.

ثم افتح نافذة الإعدادات ، وقم بتعطيل كسب EM وقم بإزالة الاختيار من خيار الوضع الذي تم اقتصاصه. أثناء الاستحواذ ، عادة ما ترتفع درجة حرارة الكاميرا حوالي درجتين إلى ثلاث درجات. وبالتالي ، قبل الحصول على صور من خلية جديدة ، انتظر حتى يتم الوصول إلى درجة حرارة العمل المثلى.

مرة أخرى ، بمجرد اكتمال التصوير ، اتبع التعليمات الواردة في المستند المصاحب لحساب متوسط الإزاحة المربعة من التصوير للحصول على متغير مصنف بالفلورسنت للجزيء محل الاهتمام. تم تصنيف خلايا CHOK one إما ب ADO 4 88 PPE أو تم نقلها بنقل في المستقبل أو T-F-R-G-F-P وتم تصويرها بواسطة TIRF كما هو موضح في هذا الفيديو. كما يتضح هنا ، فإن قانون الانتشار المقاس ل ADO 4 88 PPE مسطح ، مما يشير إلى انتشار حر في الغالب كما هو موضح سابقا من خلال استنفاد الانبعاث المحفز ، أو التحليل الطيفي للارتباط أو قياسات FCS الثابتة بعد التعدي باستخدام T-F-R-G-F-P ، قانون الانتشار المقاس ل T-F-R-G-F-P مسطح في البداية ويبقى أقل من 100 نانومتر من متوسط الإزاحة الجزيئية بمتوسط معامل انتشار ظاهري يبلغ حوالي 0.7 ميكرون مربع في الثانية.

يتبع ذلك انخفاض سريع في الانتشار الظاهري وصولا إلى 0.2 ميكرون مربع في الثانية. القيمة التي تقاس عادة بواسطة FCS محدودة للحيود. من المثير للاهتمام ملاحظة أنه كما هو موضح في هذا المثال الأخير ، يمكن للنهج الحالي بسهولة قياس متوسط الإزاحة الجزيئية بدقة بضع عشرات من النانومتر حتى باستخدام ملصقات خافتة وكثيفة نسبيا مثل GFP.

علاوة على ذلك ، فإن المقياس المكاني الذي يبدأ عنده معامل الانتشار الظاهر في الانخفاض يحدد الحجم المميز للحبس الجزئي للبروتين بواسطة الهيكل العظمي الغشائي عند حوالي 120 نانومتر بما يتماشى مع التقديرات السابقة. بمجرد إتقان إجراء تحليل البيانات ويمكن تحقيق هذا الاستحواذ في بضع دقائق. نعتقد أن هذه التقنية ستمهد الطريق للباحث في مجال البيولوجيا الخلوية والجزيئية لاستكشاف التنظيم الزماني المكاني لانتشار البروتين والدهون في عينات الحياة بسهولة وكمية.