عزل الوسيطة الإنسان الخلايا الجذعية وزراعتها على المسامية مصفوفة العظام

الخلايا الجذعية الوسيطة (MSCs) لديها إمكانية تمايز نحو سلالة بانيات العظم عندما يتم تحفيزها بعوامل قابلة للذوبان أو مواد حيوية محددة. يقدم هذا العمل خيارا جديدا لتوصيل الخلايا الجذعية الجذعية من الغشاء الأمنيوسي البشري (AM-hMSCs) الذي يستخدم مصفوفة عظام الأبقار Nukbone (NKB) كسقالة.

الهدف العام من هذا الإجراء هو زراعة الخلايا الجذعية الوسيطة البشرية على مصفوفة العظام المسامية. يتم تحقيق ذلك عن طريق عزل الخلايا الجذعية الوسيطة أولا من الغشاء الأمنيوسي البشري أو AM hcs. بعد ذلك ، يتم تحضير أقراص مصفوفة العظام المسامية لصالح التوزيع الصحيح للمغذيات لنمو الخلايا.

ثم يتم زراعة AM hcs على أقراص مصفوفة العظام المسامية. أخيرا ، يتم حساب وحدات تشكيل المستعمرة ومورفولوجيا. يتم تحليل تكاثر الخلايا والتصاق الخلايا.

في النهاية ، يتم تحليل التشكل الخلوي وعدد وحدات تكوين المستعمرات وتكاثر الخلايا والتصاق الخلايا من خلال تلوين الفحص المجهري البصري بالأصباغ الحيوية والفحص المجهري الإلكتروني الماسح على التوالي. تمتد الآثار المترتبة على هذه التقنية إلى علاجنا لإصابات العظام لأنه من الممكن توصيل الخلايا الجذعية الوسيطة إلى مواد حيوية كبيرة يسهل اختراقها تحاكي العظام الطبيعية. لعزل الخلايا الجذعية الوسيطة من الغشاء الأمنيوسي البشري ، أمسك الحبل السري بيد واحدة ، وباليد الأخرى افصل الغشاء الأمنيوسي ، الذي يشبه الصفيحة الشفافة.

إذا كان الكون موجودا في العينة ، فقم بتشريحه يدويا لفصله عن أنسجة السلى استخدم خمسة ملليلتر من PBS لغسل العينة ثلاث مرات لإزالة الدم المتبقي واستخدم ملقطا بسيطا لإزالة جلطات الدم بمشرط. قم بعمل جروح صغيرة في الغشاء الأمنيوسي لتوليد شظايا تبلغ مساحتها حوالي 0.5 سم مربع.

لهضم الغشاء ، ضع الشظايا في أنبوب مخروطي سعة 50 مليلتر وأضف خمسة ملليلتر من محلول EDTA 0.125٪ تريبسين 0.5 ملليمول. احتضان عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة 30 دقيقة قبل الدوران عند 200 جم و 25 درجة مئوية لمدة خمس دقائق. ثم تخلص من الطافف.

بعد ذلك ، أضف 15 مل من محلول الكولاجيناز من النوع الثاني واحتضنه لمدة ساعتين عند 37 درجة مئوية مع الرج العرضي وفقا لبروتوكول الحمم البركانية في al. مباشرة بعد الهضم ، أضف 15 مل من PBS وأجهزة الطرد المركزي عند 200 Gs و 25 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. تخلص من المادة الطافية واستخدم PBS لغسل حبيبات الخلية قبل الدوران مرة أخرى لمدة 15 دقيقة.

بعد التخلص من المادة الطافية ، أضف 10 مل من H-G-D-M-E-M إلى الحبيبات وأعد تعليقها عن طريق الرج برفق. لتوسيع الخلايا الجذعية الوسيطة. بذرة ملليلترين من تعليق الخلية في قارورة ثقافة وإضافة ملليلترين من حضانة H HG DMEM.

وبعد خمسة إلى سبعة أيام ، قم بإزالة الخلايا غير الملتصقة عن طريق تغيير وسط الزراعة. ثم كل ثلاثة أيام لمدة سبعة إلى 10 أيام إضافية ، قم بتغيير وسط الثقافة حتى تتماسك الخلايا بنسبة 90٪. أضف 0.125٪ تريبسين في EDTA واحتضنه لمدة خمس دقائق قبل شفط تعليق الخلية ونقله إلى أنبوب مخروطي سعة 15 مل.

بعد تدوير الخلايا والتخلص من المادة الطافية ، استخدم HG DMEM لإعادة تعليق ثقافة الحبيبات الخلية. الخلايا في قوارير 2 75 سنتيمترا مربعا وتحافظ على الثقافة عند التقاء 90٪. كرر الطلاء والطلاء حتى المقطع التاسع أو الثقافة الفرعية.

ثم استعادة الخلايا لقياس التدفق الخلوي أو دراسات أخرى. لتحضير أقراص مصفوفة العظام المسامية. ابدأ بإضافة ثلاثة ملليلتر من HG DMEM بدون FBS إلى كل قرص NKB واحتضانه طوال الليل في جو مرطب وفقا لإدارة الطيران الفيدرالية (FAA) في اليوم التالي.

ضع كل قرص في أنبوب مخروطي سعة 50 مليلتر وقم بالدوران عند 200 GS لمدة خمس دقائق لإزالة وسط الثقافة الزائد ، ثم انقله إلى لوحة ثقافة 24 بئر. أضف 500 ميكرولتر من H-G-D-M-E-M وتأكد من عدم وجود فقاعات هواء على الأقراص لصالح التوزيع الصحيح للمغذيات والخلايا. احتضن لمدة 30 دقيقة عند 25 درجة مئوية من ثلاث ثقافات فرعية ببطء وبشكل مستمر.

قم بزرع معلق خلوي على سطح قرص المواد الحيوية المزوج مسبقا واحتضانه لمدة 30 دقيقة بعد الحضانة ، أضف بعناية 1.5 مل من H-G-D-M-E-M قبل الحرب وحافظ على الثقافة لمدة ثلاثة أيام لإجراء فحص تكاثر الخلايا ، أضف 150 ميكرولترا من الملون الحيوي AB إلى عينات قرص الخلية وفقا لإرشادات الشركة المصنعة. قم بقياس الامتصاص على الفور عند 570 نانومتر بطول موجي مرجعي يبلغ 600 نانومتر. احتضان الخلايا لمدة سبعة أيام لقياس الامتصاص كل 24 ساعة.

قم بقياس وحدات تشكيل المستعمرات عن طريق زراعة 100 خلية لكل قرص زراعة الأنسجة 100 ملم في H-G-D-M-E-M واحتضانها لمدة 14 يوما. استخدم PBS لغسل المزرعة واستخدم 0.5٪ كريستال بنفسجي في الميثانول لتلطيخ الخلايا في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس إلى 10 دقائق. استخدم PBS لغسل الألواح مرتين قبل استخدام المجهر لحساب الخلايا كما هو موضح في الرسوم البيانية لقياس التدفق الخلوي.

كان عدد الخلايا المعزولة من الغشاء الأمنيوسي متفاعلا بقوة مع علامات اللحمة المتوسطة السطحية CD 90 و CD 73 و CD 1 0 5 وكان رد فعلها سلبيا على علامات المكونة للدم CD 34 و CD 45 مما يشير إلى أن AM HSCs كانت في الواقع وسيطة. كما هو موضح في هذه الصور المجهرية ، كان سطح المادة الحيوية مغطى بخلايا كروية في اليوم الأول ويبدو أن AMCs مرتبطة بسطح مصفوفة الأبقار في اليوم السابع. من خلال عمليات تعبئة podal عند تكبير أعلى ، تقيم الخلايا اتصالا ببعضها البعض.

يوضح هذا الرسم البياني انخفاضا طفيفا في وحدات الامتصاص النسبي لمصفوفة الأبقار. بعد يوم واحد من الحضانة ، يؤدي وجود السقالة إلى زيادة تكاثر الخلايا ، وهو أمر ذو دلالة إحصائية مقارنة بالثقافة التي تم إجراؤها في غياب مصفوفة الأبقار باستخدام مقايسة وحدة تكوين المستعمرة لتحليل الخلايا الجذعية. يوضح هذا الرسم البياني أن AM HSCs معزولة كما هو موضح في هذا الفيديو ، ومطلية بكثافات متفاوتة حافظت على قدرتها على تكوين مستعمرات منفصلة في 14 يوما في الثقافة.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية توصيل الخلايا الجذعية الوسيطة والمواد الحيوية الكبيرة المسامية.