كفاءة نقل الجينات في شبكية العين الفرخ عن الخلية الأولية دراسات الثقافة: ل السابقين البيضة Electroporation للمنهج

الهدف العام من هذا الإجراء هو تحقيق كفاءة عالية ، البلازميد ، تعداء خلايا الشبكية لتمكين الدراسات الجينية الوظيفية في مزارع الشبكية الأولية. يتم تحقيق ذلك عن طريق جمع أجنة الدجاج أولا في المرحلة 27 من نظام الهامبرغر وهاميلتون. يعد التدريج المناسب أمرا بالغ الأهمية لتحقيق الكفاءة المثلى.

الخطوة الثانية هي تشريح العيون الجنينية وإزالة ظهارة الشبكية المصطبغة التي تعرض شبكية العين العصبية. بعد ذلك ، يتم وضع كوب الشبكية في غرفة مملوءة بمحلول البلازميد. ثم يخضع للتثقيب الكهربائي في ظل ظروف محسنة باستخدام أقطاب كهربائية مصنوعة حسب الطلب بسهولة.

تتمثل الخطوات النهائية في إزالة الجسم الزجاجي والعدسة وفصل الشبكية العصبية عن خلايا مفردة للثقافة الأولية منخفضة الكثافة. في النهاية ، يمكن تصور الخلايا المنقولة من خلال التعبير عن جينات المراسل أو الكيمياء المناعية ، ويمكن تقييم التلاعب الجيني الفعال من خلال تقييم التعبير عن الجينات النهائية و / أو تغيرات الخلايا المظهرية. الميزة الرئيسية لهذه التقنية على الطرق الحالية ، مثل شفط الدهون أو التعدي الكيميائي ، هي أنها تزيد من معدل تعداء خلايا الشبكية بمقدار خمسة أضعاف مما ينتج عنه كفاءات تتراوح من 22 إلى 25٪ من إجمالي عدد الخلايا.

يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال بيولوجيا المستقبلات الضوئية ، لأنها تسمح بالتلاعب بالتعبير الجيني في مزارع الشبكية الأولية بمستوى من الكفاءة يمكن أن يوفر رؤى ذات مغزى بيولوجيا. تمتد الآثار المترتبة على هذه التقنية إلى ما هو أبعد من البحث الأساسي حيث يمكن تكييفها بسهولة مع تقنيات الإنتاجية العالية لتطوير الأدوية. ابدأ باحتضان بيض الدجاج المخصب ذو الساق البيضاء عند 37.5 درجة مئوية و 60٪ رطوبة نسبية لمدة خمسة أيام في حاضنة البيض.

قبل التجربة، احصل على خيوط صندوقية تستخدم عادة في سحب الماصات الدقيقة. استخدم الملقط لفك الصندوق المربع وتصويب الفتيل في شريط طويل. ثم باستخدام المسطرة كدليل ، قم بثني الفتيل في شكل حرف U مربع ، بطول ثلاثة ملليمترات عند القاعدة وارتفاعه ملليمترين في جانب واحد مع الجانب الآخر ، يستخدم الطول المتبقي من الفتيل ملقطا لغمس القطب في 96٪ من الإيثانول وإشعال القطب لفترة وجيزة من أجل تعقيمه.

ثم قم بتوصيل سلك كهربائي بمشبك تمساح صغير بالذراع الطويلة للقطب. بعد ذلك ، قم بتنظيف القطب الكهربائي ذو الرأس الذهبي السميك باستخدام 70٪ من الإيثانول. ثم قم بإعداد غرفة التثقيب الكهربائي عن طريق قطع غطاء أنبوب طرد مركزي دقيق معقم سعة 1.5 مليلتر باستخدام مقص معقم وتثبيته على جانب مسطح لأسفل على طبق بتري 100 ملم باستخدام شريط لاصق.

بعد ذلك ، قم بتعقيم أدوات microdisect عن طريق غمس أطراف الأدوات في 96٪ من الإيثانول وإشعالها لفترة وجيزة. أيضا ، امسح نطاق التشريح باستخدام 70٪ من الإيثانول. قم بتسخين زجاجة من محلول الملح المعقم الخالي من الكالسيوم والمغنيسيوم في حمام مائي بدرجة حرارة 37 درجة مئوية.

بمجرد أن يسخن ، استخدمه لملء طبق بتري معقم بحجم 100 ملم ثلاثة أرباع الطريق ممتلئا. بعد ذلك ، ضع غرفة التثقيب الكهربائي تحت مجهر تشريح نظيف. ثم قم بتوصيل الأقطاب الكهربائية بجهاز التثقيب الكهربائي ، وتأكد من توصيل القطب الكهربائي المصنوع خصيصا بالقطب السالب ، وأن القطب الكهربائي ذو الرأس الذهبي متصل بالقطب الموجب للماكينة.

نظف البيض عن طريق مسح الجزء الخارجي من القشرة بنسبة 70٪ من الإيثانول. كن حذرا وحافظ على العقم طوال بقية البروتوكول. لتجنب نقل التلوث إلى الثقافات باستخدام ملقط مالوني المنحني الكبير ، افتح ثقبا في قشر البيض بعناية عن طريق النقر برفق على الطرف المستدير للبيضة مباشرة فوق حجرة الهواء.

اسحب كل قطع القشرة بزوج آخر من الملقط. قم بإزالة الأغشية وجمع الجنين عن طريق إخراجه بعناية من البيضة. ضع الجنين في طبق بتري مع محلول ملح هانكس بالانس الخالي من الكالسيوم والمغنيسيوم.

عندما يتم جمع عدد مناسب من الأجنة ، تأكد من أنها جميعا في المرحلة الصحيحة. وفقا لنظام التدريج الهامبرغر وهاميلتون لتحقيق الكفاءة المثلى ، يجب أن تكون الأجنة في المرحلة 27. قم بالقتل الرحيم للأجنة عن طريق قطع الرأس باستخدام ملقط مالوني ، ثم استخدم ملاقط دومون لنواة العينين بعناية.

انقلي العينين إلى طبق بتري جديد مع HBSS خال من الكالسيوم والمغنيسيوم. ابدأ من الجزء الخلفي من كل عين بالقرب من رأس العصب البصري ، ثم أدخل طرفا واحدا من كل زوج من ملاقط دومون بين الشبكية العصبية والظهارة المصطبغة في الشبكية. من خلال العمل من الجزء الخلفي من العين باتجاه الأمام ، استخدم الملقط لتشريح ظهارة الشبكية المصطبغة بعناية.

توخي الحذر من إتلاف شبكية العين العصبية. قم بإعداد المعالج الكهربائي لتوصيل خمس نبضات مربعة بجهد 15 فولت بمدة 50 مللي ثانية وفاصل زمني قدره 950 مللي ثانية. بعد ذلك ، املأ غرفة التثقيب الكهربائي ب 120 ميكرولتر من محلول البلازميد بتركيز 1.5 ميكروغرام لكل ميكرولتر في PBS.

ثم ضع القطب السالب على شكل حرف U داخل غرفة التثقيب الكهربائي لغطاء جهاز الطرد المركزي الصغير. باستخدام زوج من ملاقط دومون المنحنية. انقل كوبا واحدا من الشبكية إلى حجرة التثقيب الكهربائي وضعه داخل القطب الكهربائي على شكل حرف U.

ضع شبكية العين بحيث يكون الجزء الخلفي منها باتجاه أسفل القطب والعدسة متجهة لأعلى. بعد ذلك ، ضع الأنود بحيث يلامس الجزء الأمامي من العين بجوار العدسة. ثم استخدم دواسة قدم المهاجم الكهربائي لتوصيل خمس نبضات كهربائية.

عند الانتهاء ، انقل كوب الشبكية الكهربائي إلى طبق بتري جديد مليء ب HBSS الخالي من الكالسيوم والمغنيسيوم. كرر إجراء التثقيب الكهربائي مع كل كوب شبكية إضافي. يمكن تزويد ما يصل إلى ستة أكواب شبكية كهربائية بنفس محلول البلازميد دون انخفاض كبير في كفاءة التعداد.

بعد ذلك ، استخدم ملقط السنين لإزالة العدسة والجسم الزجاجي برفق من كل عينة كهربائية مع تثبيت العين في مكانها مع الجزء الخلفي من ملاقط دومون المنحنية بمجرد إزالتها ، انتقل إلى تفكك وثقافة خلايا الشبكية الكهربائية باستخدام التقنيات القياسية. تم تزويد خلايا الشبكية الموضحة هنا بالكهرباء بتعبير GFP ، وبلازميد ، وفصلها ، وزرعتها لمدة أربعة أيام. أظهرت الصور المجهرية الفلورية نوى بقع رديئة و GFP تعبر عن خلايا الشبكية.

تم إجراء تلطيخ الأجسام المضادة للفيسين لتحديد الخلايا المستقبلة للضوء. تم تحسين المعلمات الموضحة في هذا البروتوكول للحصول على كفاءات شفافة يبلغ متوسطها 22٪ عند مقارنتها بإجمالي السكان بعد أربعة أيام. في الثقافة ، يزداد هذا المقياس إلى متوسط 25٪ من الكفاءة عندما يتم اعتبار عدد المستقبلات الضوئية فقط بمجرد إتقانها.

يمكن إجراء هذه التقنية من جمع الأجنة إلى العملية الكهربائية في أقل من 30 دقيقة لست عيون إذا تم إجراؤها بشكل صحيح. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر أنه يجب ألا تمر أكثر من ثلاث ساعات بين جمع الأجنة وطلاء الخلايا المنفصلة من أجل الحصول على ثقافة ذات نوعية جيدة. يمكن تطبيق هذه التقنية على الإفراط في التعبير الجيني أو الارتباط ، على سبيل المثال ، باستخدام نظام RNAi.

بالإضافة إلى ذلك ، يمكن استخدام شبكية العين التي تم نقلها بعد هذا الإجراء لثقافات الشبكية العضوية.