قياس الحساسية المفرطة المحلية في الفئران

الهدف العام من هذا الإجراء هو قياس التغيرات في نفاذية الأوعية الدموية ، لتحديد استجابات الحساسية الموضعية. يتم تحقيق ذلك عن طريق توعية أولا لمسببات الحساسية ، مثل O الألبومين. الخطوة الثانية هي تحدي الأذنين بحقن داخل الأدمة من مسببات الحساسية.

ثم يتم حقن صبغة إيفان الزرقاء في وريد الذيل. الخطوة الأخيرة هي استخراج الصبغة من الأذنين الصعبة عن طريق احتضانها طوال الليل. في الشكل ، يتم استخدام أميد القياس الضوئي الطيفي في نهاية المطاف لتحديد كمية الصبغة التي دخلت الأذن.

الميزة الرئيسية لهذه التقنية على الطرق الحالية هي أن تسرب الصبغة يقاس عن طريق قياس الطيف. هذا يعني أن الاختبار لا يخضع بسهولة لتحيز المراقب. بشكل عام ، سيكافح الأفراد الجدد في هذه الطريقة لأن حقن الوريد داخل الأدمة والذيل تمثل تحديا تقنيا وتتطلب الكثير من الممارسة لتحقيق الكفاءة.

ابدأ بإحضار كمية من محلول مرق البويضات إلى درجة حرارة الغرفة للاستخدام. عندما تكون في درجة حرارة الغرفة ، قم بتخفيف مرق البويضات إلى ملليغرام واحد لكل مليلتر بتركيز XPBS واحد. استخدم أنبوبا دائريا دائريا من البوليسترين سعة خمسة ملليلتر.

دوامة الأنبوب بسرعة متوسطة ، وإضافة حجم متساو بعناية من المتجانسة تماما. حقن الشب في محلول البويضات بالتنقيط. في موازاة ذلك ، قم بإعداد محلول تحكم سلبي من الشب الممزوج في PBS بنسبة واحد إلى واحد باستخدام نفس التقنية.

ثم قم بتغطية الأنابيب وثبتها في الدوامة. قم بتشغيل الدوامة في أدنى إعداد لمدة نصف ساعة مع توصيل الأنابيب. عندما تكون الحلول جاهزة ، تابع على الفور توعية فئران BAB.

قم بتحميل مزيج الشب البويضات في حقنة سعة مليلتر واحد. ثم باستخدام إبرة قياس 27 ، قم بحقن 100 ميكرولتر في الصفاق لكل فأر. كرر هذا مع الفئران ذات المراقبة السلبية التي تستخدم محلول الشب بدون بويضات خلال الأسابيع الثلاثة المقبلة.

كرر هذه العملية لما مجموعه ثلاث حقن لكل فأر بعد الحقن الأخير ، وانتظر أسبوعين على الأقل قبل إجراء فحص الحساسية المفرطة الموضعي من مخزون البويضات المجمدة. ابدأ بصنع حل عمل بمقدار خمسة ملليغرام لكل مليلتر في PBS. دوامة لفترة وجيزة ، باستخدام 5٪ فلور ISO.

قم بتخدير فأر حساس ، وعندما يصبح غير متحرك ، اطلب الفلور ISO إلى 3٪ الآن قم بتحميل حقنة الأنسولين بثلاثة 10 ميكرولتر من مستحضر البويضات ، وقم بتغطيتها بإبرة قياس 31 وقم بتحميل حقنة ثانية ب 10 ميكرولتر من XPBS واحد. بعد ذلك ، قم بلف أنبوب مخروطي سعة 15 مليلتر بشريط لاصق شفاف ، وقم بتثبيت الجانب الظهري للأذن اليسرى للفأر المخدر بالأنبوب. أدخل إبرة حقنة PBS المخروطية لأعلى بين ورقتي الأذن وحقن 10 ميكرولتر كاملة ببطء.

تجنب اصطدام الأوعية الدموية. سيؤدي الحقن الناجح إلى ظهور ومضة واضحة داخل الأدمة. من الأهمية بمكان حقن الحجم بالكامل في الأذن.

في حالة تسرب أي سائل من موقع الحقن ، لا يمكن استخدام في التحليل. أيضا ، إذا مرت الإبرة عبر الأذن تماما أو خدشت سطح الأذن ، فإن الفحص غير صالح لأن هذه الصدمات ستربك النتائج في الأذن اليمنى. استخدم نفس الطريقة لحقن البويضات خلال فترة الثلاث دقائق.

انقل الماوس إلى مصفاة وضعها تحت مصباح حراري. ثم قم بحقن 200 ميكرولتر ببطء من 0.5٪ صبغة إيفانز الزرقاء في الوريد الذيل. باستخدام إبرة قياس 27 ، يمكن أن يكون الحقن السريع ضارا إذا تم تدمير الوعاء قبل حقن كل الصبغة.

استمر في الحقن على الجانب الآخر من الذيل. انتظر الآن 10 دقائق ثم قتل الفأر بثاني أكسيد الكربون ، متبوعا بخلع عنق الرحم. بمجرد القتل الرحيم للحيوان ، استخدم الملقط والمقص لإزالة الأذنين.

أمسك حافة الأذن بالملقط دون الضغط على موقع الحقن. ثم قطع بالقرب من حافة الغضروف عند قاعدة الأذنين ، ولكن ليس من خلالها. اجمع أكبر قدر ممكن من الأنسجة.

الآن مع اتخاذ الاحتياطات المناسبة ، قم بإخراج 700 ميكرولتر من شكل أميد لكل أذن في أنبوب طرد مركزي صغير. انقل الأذن إلى كل أنبوب واحتضانها طوال الليل عند 63 درجة مئوية في كتلة حرارية جافة ، وفي اليوم التالي سيتم استخراج معظم الصبغة ، لكن الأذنين قد تظهر زرقاء قليلا. أضف 300 ميكرولتر من كل عينة في نسختين إلى طبق 96 بئر.

تجنب نقل أي فرو ولا تشكل أي فقاعات للفراغات. قم بتحميل بئرين ب 300 ميكرولتر من شكل أميد. ثم قم بقياس الامتصاص عند 620 نانومتر.

اطرح القيم من الخلفية وحلل النتائج. لم تتفاعل الحساسة PBS مع تحدي البويضات أو تحدي PBS. كما هو متوقع ، ظلت كلتا الأذنين بيضاء.

كان العام الذي تلقى تحدي PBS في الحساسة ل OVAs إما أبيض تماما أو أزرق فاتح ، موضعيا في موقع الحقن حيث أصبحت أذنيه اللتان تتلقيان تحدي البويضات أغمق بشكل تدريجي لمدة 10 دقائق بعد إعطاء الصبغة ، وكان لأنسجة الأذن المعالجة IDE للحيوانات الحساسة ب PBS قراءات امتصاص ضئيلة بعد كل من تحدي PBS و OVA. بينما بالنسبة للحيوانات الحساسة للبويضات ، أدى حقن PBS بشكل عام إلى قراءة متوسط امتصاص تبلغ 0.13. على العكس من ذلك ، أدى تحدي البويضات البالغة 50 ميكروغراما إلى متوسط قراءة الامتصاص 0.58.

يمكن تعديل كمية البويضات المستخدمة في التحدي ضمن حدود. على سبيل المثال ، أدى 20 ميكروغراما من التحدي إلى متوسط امتصاص 0.30. ومع ذلك ، فإن التحدي الذي يقل عن 20 ميكروغراما لم يعط نتائج موثوقة.

على الرغم من أنه يمثل تحديا بمجرد أن يتقن الشخص الحقن داخل الأدمة والوريد ، إلا أنه يمكن إجراء هذه التقنية على واحد في حوالي 15 دقيقة مع عمل شخصين معا ، أحدهما يقوم بحقن الأذن والآخر يقوم بحقن وريد الذيل. يمكن تنفيذ الإجراء على 10 في حوالي ساعة. هذا الاختبار متعدد الاستخدامات للغاية حيث يمكن استخدامه لكل من الحساسية المفرطة الجلدية النشطة والسلبية.

يمكن استخدامه أيضا لمجموعة متنوعة من مسببات الحساسية. لا تنس أن الفلور يمكن أن يكون له آثار سلبية على الجهاز التناسلي البشري. استخدمه فقط في غرفة جيدة التهوية واحصل على علبة كشف متصلة بغرفة الحث لتحييد الغازات العادمة إذا كنت حاملا.

أثناء استخدام الفلور ، ارتد قناع فلتر الكربون لتقليل التعرض.