كفاءة الجذع الجيل خلية من الدم عن طريق Episomes وHDAC المانعون

الهدف العام من التجربة التالية هو توليد خلايا جذعية مستحثة متعددة القدرات خالية من التكامل من كمية صغيرة من الدم المحيطي. يتم تحقيق ذلك عن طريق زراعة خلايا الدم المحيطية أحادية النواة المعزولة في عوامل نمو محددة لإنتاج مجموعة من سلف كريات الدم الحمراء تستجيب بشدة لإعادة البرمجة. كخطوة ثانية ، يتم إدخال البلازميدات العرضية غير المدمجة التي تحمل جينات إعادة البرمجة في الأرومات الحمراء عن طريق عاطفة النواة لبدء عملية إعادة البرمجة.

بعد ذلك ، يتم طلاء الخلايا المصابة بالنواة على طبقة من الخلايا الليفية الجنينية للفأر المشععة للسماح بإعادة البرمجة المستمرة بنجاح في النهاية. يمكن تحديد مستعمرات الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات المعاد برمجتها بناء على خصائصها المورفولوجية ، ونشاط الفوسفاتيز القلوي ، والكيمياء المناعية الإيجابية لعلامات متعددة القدرات والتعبير عن جينات متعددة القدرات الذاتية. الميزة الرئيسية لهذه التقنية على الطرق الحالية مثل إعادة البرمجة القائمة على الفيروس ، هي أن هذا البروتوكول يضمن توليدا ثابتا ل IPSC المجاني للتكامل ، وإظهار الإجراء اليوم سيكون جيسي وأنا وجريتشن جونسون.

فني في المختبر ابدأ بتخفيف الدم المحيطي بنسبة واحد إلى واحد في DPBS. ثم في أنبوب بوليسترين دائري القاع سعة 15 مليلتر ، ضع بعناية سبعة ملليلتر من الدم المخفف على ثلاثة ملليلتر من درجة حرارة الغرفة في عبوة مرحبا. بعد فصل العينة لمدة 30 دقيقة عند 400 GS ودرجة حرارة الغرفة ، سيكون pbmc قد استقر في طبقة الواجهة البيضاء الغائمة بين البلازما والعبوة العالية الفيالية.

باستخدام ماصة نقل معقمة، انقل P BMCs إلى أنبوب مخروطي سعة 15 مليلتر وارفع الحجم إلى 10 ملليلتر باستخدام DPBS الجديد. ثم بعد عد الخلايا ، انقل مرتين 10 إلى ستة P BMCs إلى أنبوب مخروطي جديد سعة 15 مليلتر وقم بتدوير الخلايا المتبقية ، وقم بتجميد الخلايا المحببة عند مرتين في 10 إلى ستة pbmc لكل تركيز مليلتر في 90٪ مصل بقري للجنين مع 10٪ ثنائي ميثيل سلفوكسيد. ثم بعد تدوير P BMCs التي تم وضعها جانبا ، نقوم بتعليق الحبيبات في ملليلترين من وسط التمدد المحضر حديثا ونضعها في بئر واحد من 12 لوحة زراعة أنسجة جيدة لاحتضان الخلايا في حاضنة رطبة 37 درجة مئوية مع جو من 5٪ أكسجين و 5٪ ثاني أكسيد الكربون و 90٪ نيتروجين.

ثم في اليومين الثالث والسادس ، استبدل الوسائط بجمع الخلايا من البئر. غسل البئر بملليلترين من QBSF 60 لجمع أي خلايا متبقية ، وتكوير الخلايا عن طريق الطرد المركزي ، ثم تعليق الحبيبات في ملليلترين من وسط التمدد الجديد. ثم أعد الخلايا إلى نفس لوحة 12 بئر واستمر في الحضانة في اليوم التاسع ، قم بإعادة برمجة البلازميدات في أنبوب معقم سعة 1.5 مليلتر كما هو موضح في الجدول.

بعد ذلك ، امزج محلول المودة النواة مع المكملات الغذائية التي توفرها الشركة المصنعة ونقل الخليط إلى أنبوب DPH معقم 1.5 ملليلتر. ثم قم بتوزيع ملليلترين من وسط التمدد في بئر واحد من صفيحة جديدة سعة 12 بئر وقم بموازنة الوسط في حاضنة 37 درجة مئوية المرطبة حتى تصبح الخلايا جاهزة. اجمع الخلايا واغسل ثقافة الخلايا جيدا كما هو موضح للتو واغسل الخلايا في خمسة ملليلتر من DPBS.

ثم إعادة التشكيل ، قم بتعليق حبيبات الخلية في 100 ميكرولتر من محلول المودة النووي بالإضافة إلى الملحق مع الحرص على تجنب توليد الفقاعات ونقل تعليق الخلية إلى الأنبوب الذي يحتوي على بلازميد إعادة البرمجة. امزج الخلايا عن طريق سحب العينة لأعلى ولأسفل مرة واحدة وانقل المحلول بالكامل إلى قاع النواة المودة. ثم ضع vete في آلة المودة النووية وقم بتشغيل البرنامج T 0 1 9.

أضف الآن 100 ميكرولتر من وسط التمدد المتوازن إلى vete المودة الأساسية ، واجمع العينة بأكملها على الفور لتجنب أي بقايا خلايا ميتة بيضاء عائمة وقم بإيداعها في بئر وسط التدفئة. ثم ضع الخلايا مرة أخرى في الحاضنة المرطبة في اليوم 10 أو 11. قم بتغطية كل بئر من ستة ألواح زراعة أنسجة جيدة بالجيلاتين بمليلتر واحد من 0.1٪ جيلاتين في HBSS ، ثم ضع اللوحة في الحاضنة المرطبة أو خمس دقائق على الأقل أثناء الحضانة ، انقل قارورة واحدة من الذوبان ، مرتين 10 إلى ستة 3000 درجة مئوية ممهد للفأر ، أو الخلايا الليفية ، أو الخلايا الليفية ، أو mes في 10 ملليلتر من وسائط الميثامفيتامين الدافئة ، ثم الطرد المركزي للخلايا أثناء دوران الخلايا.

استنشق محلول الجيلاتين من لوحة الآبار الستة ، ثم أعد تعليق الميس في 12 مل من وسائط الميثامفيتامين الطازجة. قم بتوزيع ملليلترين على الفور في كل بئر من الجيلاتين المطلي. ستة. طبق جيد وضع الطبق مرة أخرى في الحاضنة المرطبة حتى اليوم 12.

في اليوم 12 ، اجمع الخلايا المصابة بالنواة من البئر في أنبوب مخروطي واحد سعة 15 مليلتر ، وغسل البئر كما ثبت لجمع أي خلايا متبقية. بعد تدوير الخلايا ، نعلق الحبيبات في 12 مل من وسط إعادة البرمجة المحضر حديثا ، ونوزع ملليلترين من الخلايا في كل بئر من الخلايا المغذية. في لوحة الآبار الستة التالية ، قم بالطرد المركزي للوحة لمدة 30 دقيقة عند 75 GS ودرجة حرارة الغرفة ، ثم ضع اللوحة مرة أخرى في الحاضنة المرطبة ، وقم بتغيير الوسط كل يومين لمدة أسبوع إلى أسبوعين.

بمجرد ظهور مستعمرات الخلايا متعددة القدرات المحفزة ، ابدأ في تغذية الخلايا بوسط الخلايا الجذعية الجنينية البشرية المحضرة حديثا والذي يحتوي على مثبطات هيستون ديستيلاز بعد ثلاثة أيام من عاطفة النواة وقبل الطلاء ، الخلايا المصابة بالنواة على الميثامفيتامين المحفز. يجب تقدير كفاءة المودة النووية الناجحة ل NU عن طريق المجهر الفلوري بالنسبة ل EGFP ، على سبيل المثال ، الموضح هنا هو تجربة عاطفة النوى النموذجية مع ما يقرب من خمسة إلى 10٪ من إجمالي مجموعة الخلايا التي تعبر عن مستعمرات الخلايا الجذعية المحفزة المحفزة المعاد برمجتها EGFP ستبدأ في الظهور بعد أسبوعين تقريبا من المودة النووية NU. تكون المستعمرات بشكل عام دائرية ذات حدود محددة جيدا ويمكن التعرف عليها من خلال مورفولوجيا الخلايا الجذعية الجنينية البشرية المميزة ، بما في ذلك الخلايا الصغيرة المعبأة بإحكام ذات نسبة نووية عالية إلى السيتوبلازمية والنوى المرئية للخطوط التمثيلية التي تم تمييزها بالكامل.

تعبر جميع الاختبارات إيجابية لنشاط الفوسفاتيز القلوي عن علامات تعدد القدرات القياسية وتعيد تنشيط جينات تعدد القدرات الذاتية بمجرد إتقانها. يمكن لهذه التقنية أن تولد باستمرار IPSC مجانيا للتكامل في أربعة أسابيع إذا تم إجراؤها بشكل صحيح. بعد هذا الإجراء ، يمكن إجراء دراسات التمايز للإجابة على أسئلة حول أي نوع من الأنسجة.