التمايز كفاءة عالية من الخلايا الجذعية المحفزة الإنسان لالعضلية وتوصيف بواسطة التدفق الخلوي

الهدف العام من هذا الإجراء هو توليد ثقافات عالية الجودة من خلايا عضلة القلب من الخلايا الجذعية متعددة القدرات وتوصيف المنتج النهائي بشكل مناسب باستخدام قياس التدفق الخلوي. لتحقيق هذا ، يتم إنشاء ثقافات أحادية الطبقة عالية الجودة من الخلايا الجذعية متعددة القدرات غير المتمايزة. ثم يتم تحفيز تكوين عضل القلب عن طريق تعديل مسار الرياح باستخدام جزيئات صغيرة.

بعد ذلك ، يتم إصلاح خلايا عضلة القلب وتغلغلها وتلطيخها باستخدام ظروف محسنة خصيصا لكل جسم مضاد. أخيرا ، يتم تحليل الخلايا عن طريق قياس التدفق الخلوي. في النهاية ، يمكن الحصول على نتائج تظهر الثقافات الإيجابية للغاية لعلامات القلب ، TNNI three و IRX أربعة وتظهر إمكانات عمل شبيهة بالبطين.

الميزة الرئيسية لهذه التقنية على الأساليب الحالية مثل تلك الموجودة في أجسام الموظفين والجديلة ، هي أنها سهلة التنفيذ نسبيا وفعالة من حيث التكلفة. علاوة على ذلك ، تولد هذه التقنية ثقافات من الخلايا الإيجابية للغاية لكل تروبونين قلبي I.بدون التباين الداخلي الأساسي والكفاءة التي لوحظتها البروتوكولات الأخرى ، يعد العرض المرئي للطريقة أمرا بالغ الأهمية لأن جودة الخلية قبل التمايز ستؤثر بشكل كبير على كفاءة التمايز. كما أن التثبيت غير الصحيح والنفاذية قبل تلطيخ الأجسام المضادة سيؤدي إلى نتائج قياس التدفق الخلوي دون المستوى الأمثل مما يدل على أن الإجراء سيكون شابو بشار ، طالب دراسات عليا من مختبري.

الجانب الأكثر تحديا في الإجراء التالي هو الحفاظ على خلايا جذعية متعددة القدرات غير متمايزة عالية الجودة قبل التمايز. سيؤثر استخدام الخلايا ذات خصائص النمو دون المستوى الأمثل بشكل كبير على كفاءة التمايز. ابدأ هذا الإجراء باستخدام الحوسبة عالية الأداء الراسخة المزروعة في ستة أطباق مطلية بمصفوفة مؤهلة من HESC.

افحص الخلايا تحت المجهر للتأكد من أنها تظهر مورفولوجيا متجانسة. إذا أظهرت الخلايا مورفولوجيا ظهارية عصبية أو ليفية مثل مورفولوجيا كما هو موضح هنا ، فلا ينبغي استخدامها. تأكد من أن الخلايا تتكاثر بقوة عند الجلوس عند 0.75 مليون لكل بئر ، ومرورها كل ثلاثة أيام تقريبا عند 75٪ التقاء ، تمر الخلايا مع تفكك إلى مستوى الخلية المفردة خمس مرات على الأقل قبل بدء التمايز للمرور.

تستنشق الخلايا أولا وسط النمو E ثمانية وتغسل الخلايا مرتين بأربعة ملليلتر من PBS قبل التسخين إلى درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك ، أضف ملليلترا واحدا من محلول انفصال الخلية بدرجة حرارة الغرفة إلى كل بئر واترك البئر دون إزعاج حتى تبدأ حدود الخلية في التقريب. يستغرق هذا عادة من ثلاث إلى سبع دقائق ويمكن ملاحظته مجهريا وتأكيده باستخدام المجهر.

بعد ذلك ، باستخدام ماصة زجاجية مسدودة بالقطن مع لمبة ، أزاحت الخلايا ونقلها إلى أنبوب مخروطي سعة 15 مليلتر يحتوي على مليلتر واحد من وسط DM EMF 12. سيؤدي هذا إلى تعطيل محلول انفصال الخلية. قم بإزالة 10 ميكرولتر من محلول الخلية واخلطه مع 10 ميكرولتر من تريان الأزرق في أنبوب طرد مركزي صغير.

عد الخلايا ثم لجمعها أجهزة الطرد المركزي ، الأنبوب المخروطي سعة 15 مليلتر عند 130 GS لمدة خمس دقائق. في درجة حرارة الغرفة أثناء الطرد المركزي ، قم بحساب الخلايا باستخدام مقياس الخلوي الدموي الآلي. توقع 70 إلى 80٪ من الجدوى في المستقبل.

قم ببناء جميع أرقام الخلايا على إجمالي عدد الخلايا بدلا من عدد الخلايا القابلة للتطبيق. بعد الدوران ، استنشق الوسط وإعادة تعليق حبيبات الخلية في D-M-E-M-F 12 إلى تركيز نهائي يبلغ 0.75 في 10 إلى الخلايا الست لكل 500 ميكرولتر ، أضف 0.5 مل من تعليق الخلية إلى كل بئر من صفيحة ستة آبار تحتوي فيها كل بئر على ملليلتر من E ثمانية متوسط. باستخدام مثبط الصخور ، قم بهز اللوحة برفق من الأمام إلى الخلف ومن جانب إلى آخر لتفريق الخلايا بشكل موحد عبر البئر.

أعد الخلايا إلى الحاضنة عند 5٪ من ثاني أكسيد الكربون و 37 درجة مئوية. بعد 24 ساعة من التعبئة. ابدأ في استبدال الوسط يوميا باستخدام ملليلترين لكل بئر من E ثمانية بدون مثبط للصخور.

تحسين كثافة البذر لتحقيق التقاء بنسبة 100٪ قبل بدء التمايز. في اليوم صفر ، تكون الخلايا متماسكة بنسبة 100٪ مع مورفولوجيا مضغوطة والحد الأدنى من بقايا الخلايا. ابدأ عملية التمايز عن طريق استبدال وسط E ثمانية بملليلترين من التمايز. متوسط.

رقم واحد ، أضف 1.2 ميكرولتر من CHIR لكل منهما. حسنا في اليومين الأول والثاني ، من الشائع ملاحظة موت كبير للخلايا بنسبة 40 إلى 50٪. ومع ذلك ، ستحتفظ الخلايا المرفقة بالتشكل المضغوط.

خلال هذا الوقت ، يصبح الوسط برتقاليا وعكرا. إذا لوحظ الوسط الوردي ، الذي يشير إلى الموت المفرط للخلايا ، فتأكد من صلاحية الخلية باستخدام triam blue وتوقف إذا تجاوز موت الخلايا 70٪ خلاف ذلك ، في اليوم الأول ، كرر عملية استبدال الوسائط بملليلترين من التمايز الجديد. متوسط. أولا ، أضف 1.2 ميكرولتر من CHIR إلى كل بئر وفي الأيام الثانية إلى الثالثة ، استبدلها بوسط تمايز جديد.

أولا ، خلال الأيام من الثالث إلى الرابع ، ستتعافى الخلايا وستزداد الكثافة في اليوم الرابع. استبدل الوسط في كل بئر بتمايز جديد. متوسط رقم واحد وميكرولتر واحد من IWR واحد.

خلال الأيام من الخامس إلى السادس ، يحدث الحد الأدنى من موت الخلايا وقد تبدأ بقع كثيفة في الظهور في اليوم الخامس ، واستبدل الوسط بتمايز جديد. متوسط رقم واحد ، وأضف ميكرولتر واحد من IWR واحد إلى كل بئر في اليوم السادس إلى السابع ، واستبدل الوسيط بالتمايز الجديد. متوسط رقم واحد.

بحلول اليوم السابع إلى الثامن ، يتم تحقيق طبقة أحادية متجانسة مع مورفولوجيا مدمجة تتخللها بقع كثيفة. بحلول اليوم الثامن ، ستبدأ الخلايا في الانقباض تلقائيا وغالبا ما تكون الانقباضات الأولى مرئية في البقع الكثيفة. في اليوم الثامن ، استبدل الوسيط بتمايز جديد. متوسط.

رقم اثنين ، استمر في استبدال وسيط التمايز رقم اثنين ، كل يومين طوال مدة الثقافة. بحلول اليوم 10 ، لوحظ انكماش أكثر قوة وسيستمر في الانتشار في جميع أنحاء الثقافة في الأيام اللاحقة. يظهر هذا الفيديو الخلايا في اليوم 30 وهنا تظهر الخلايا في اليوم 55.

لجمع الخلايا لقياس التدفق الخلوي ، قم بإجراء جمع تفكك الخلايا وعدها كما تم إجراؤه سابقا. لاحظ أن الخلايا لا تحتاج إلى أن تبقى معقمة في هذه المرحلة. أثناء دوامة حبيبات الخلية برفق, أضف 100 ميكرولتر من محلول التثبيت إلى حبيبات الخلية بالتنقيط.

ثم احتضن الأنبوب على الجليد لمدة 15 دقيقة. أضف ثلاثة ملليلتر من محلول غسل الخلايا ، واجمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي بعد الدوران ، وشفط المحلول أثناء الدوامة. أضف 100 ميكرولتر من المحلول المنفذ إلى حبيبات الخلية بالتنقيط كما كان من قبل.

ثم احتضن الأنبوب على الجليد لمدة 30 دقيقة. أضف ثلاثة ملليلتر من محلول غسل الخلايا. اجمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي وشفط المحلول.

كرر لمدة غسلتين بعد التغلغل. قم بتلطيخ الأجسام المضادة كما هو موضح في المستند المصاحب باستخدام ماصة P 1000 عند 400 ميكرولتر من محلول صيانة الخلايا للخلايا وقم بتفكيكها عن طريق سحب العينات لأعلى ولأسفل. بعد ذلك ، قم بترطيب غطاء مصفاة الخلية مسبقا على أنبوب دائري القاع مع 50 ميكرولتر من محلول صيانة الخلية.

ضع الأنبوب على الجليد. يمنع غطاء مصفاة الخلية مجاميع الخلايا من انسداد مقياس التدفق الخلوي. بعد ذلك ، انقل محلول الخلية إلى غطاء مصفاة الخلية واترك تعليق الخلية بالتصريف عن طريق الجاذبية.

اضغط على الجزء السفلي من الأنبوب برفق على الجزء العلوي من المقعد بحيث يتم تجميع الخلايا في أنبوب. ضع الأنبوب مرة أخرى على الجليد في أسرع وقت ممكن. اشطف المصفاة ب 250 ميكرولتر من محلول صيانة الخلايا لضمان أقصى قدر من التعافي للخلايا.

حافظ على الخلايا على الجليد وحمايتها من الضوء حتى يتم تحليلها عن طريق قياس التدفق الخلوي لتحديد جودة خلايا عضلة القلب المتولدة. باستخدام هذا البروتوكول ، تم تمييز الخلايا لمدة 10 أيام وتلطيخها بالأجسام المضادة ضد TNNI ثلاثة أ ، وعلامة خلية عضلة القلب ، و TNNT اثنين علامة عضلية مخططة ، و IRX أربعة علامة عضلة القلب البطينية. لاحظ أنه تم تحسين ظروف التثبيت والنفاذية لكل جسم مضاد لتحقيق أقصى نسبة مئوية من الخلايا الموجبة.

تظهر الرسوم البيانية أن 99٪ من الخلايا المسورة كانت إيجابية ل TNNI ثلاثة و 96٪ كانت إيجابية ل IRX أربعة. بالإضافة إلى ذلك ، كانت الخلايا إيجابية للغاية لعلامات التمايز القلبية الأخرى ، بما في ذلك TNNT two و MLC two V و MLC two. ملاحظة أن التأكيد على نقاء خلايا عضلة القلب وهوية الخلية يعتمد على TNNI ثلاثة و IRX أربعة.

تلطيخ MC two V و MC two A غير مقيدين بالغرفة أثناء التطور ، كما تم العثور على TNNT two في العضلات الهيكلية. تم تسجيل إمكانات الفعل الموضحة هنا من خلية عضلة قلبية واحدة متقلصة تلقائيا في اليوم 46 من التمايز باستخدام لقط رقعة الخلية بأكملها. يشير ملف تعريف جهد الفعل إلى أنه تم الحصول على خلايا عضلة القلب البطينية مثل القلب.

كما لوحظت نسبة صغيرة من الملامح الشبيهة بالعقدية. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية توليد ثقافات عالية الجودة من خلايا عضلة القلب من الخلايا الجذعية متعددة القدرات وكيفية توصيفها عن طريق قياس التدفق الخلوي. بشكل عام ، سيكافح الأفراد الجدد في هذه الطريقة بسبب التحديات الشائعة التي يواجهونها في الحفاظ على الخلايا الجذعية كطبقات أحادية عالية الجودة قبل بدء التمايز.

لا تنس أن العمل باستخدام مثبت يمكن أن يكون خطيرا وشخصيا. يجب دائما ارتداء معدات الحماية مثل معطف المختبر أو القفازات أثناء تنفيذ هذا الإجراء.