الفيزيولوجيا الكهربائية بتقنية تثبيت الرقعة (Patch Clamp)
تحتوي أغشية الخلايا العصبية على قنوات أيونية تتحكم في حركة الشحنات إلى داخل الخلية وخارجها، وبذلك تنظم عملية إطلاق السيالات العصبية. وتعد تقنية تسجيل…
يعد تسجيل تثبيت الرقعة (Patch clamp) تقنية مفيدة للغاية لاستقصاء الخصائص الفيزيائية الحيوية للقنوات الأيونية التي تتحكم في التنشيط العصبي.
تتضمن هذه العملية ضغط أنبوبة مجهرية زجاجية ضد خلية ما لعزل "رقعة" صغيرة من الغشاء تحتوي على قناة أيونية واحدة أو أكثر.
ويسمح الإعداد التجريبي للعلماء كذلك بـ "تثبيت" البيئة الكهربائية للمنطقة المرقعة من خلال التحكم الدقيق في الجهد عبر غشاء الخلية، وهو ما يؤثر -بناءً على القنوات الأيونية الموجودة- على تدفق الأيونات عبر الغشاء ويتيح دراسة تفصيلية لهذه القنوات.
يقدم هذا الفيديو نظرة عامة على المبادئ التي تقوم عليها تقنية تثبيت الرقعة ، ووصفاً للخطوات اللازمة لإجراء التجربة، وأخيراً بعض تطبيقات هذه الطريقة.
أولاً، دعونا نراجع المبادئ الكامنة وراء تقنية الرقعة (patch)تسجيل تثبيت الجهد.
يختلف عدد الأيونات ذات الشحنة الموجبة والسالبة داخل العصبون عن عددها الموجود في الخارج.
يؤدي هذا الاختلال في التوازن إلى حدوث فرق في الجهد، أو ما يُعرف بجهد الغشاء، يبلغ حوالي -70 ملي فولت، مما يعني أن الشحنات في الداخل أكثر سلبية منها في الخارج.
تساعد القنوات الأيونية في الحفاظ على التدرج من خلال التحكم في حركة الأيونات عبر غشاء الخلية، والتي تمثل في الأساس تيارات كهربائية.
باستخدام تقنية تثبيت الرقعة (patch clamp)، يطرح العلماء تساؤلات حول طبيعة الجهد والتيار.
تتكون منصة تثبيت تثبيت الرقعة (patch clamp rig) من ماصّة زجاجية دقيقة، تحتوي على محلول أيوني وقطب فضة مكلورة لقياس الجهد والتيارات الكهربائية.
تحتوي طرف الماصة الدقيقة (micropipette) على فتحة مصقولة بقطر ميكرون واحد تحيط بمساحة صغيرة من الغشاء.
للقضاء على ضوضاء الخلفية الناتجة عن الأيونات الموجودة في محلول الحمام، يتم تكوين سدادة عالية المقاومة بين الماصة ورقعة الغشاء. وبما أن مقاومة هذه السدادة تقع في نطاق الجيجا أوم، فإنها تُعرف باسم سدادة الجيجا أوم.
يتصل القطب الموجود داخل الماصة بمضخم يمكنه تضخيم تقلبات التيار والجهد الناتجة عن حركة الأيونات عبر القنوات الموجودة في الغشاء البلازمي.
باستخدام المضخم، يستطيع العلماء تثبيت جهد الغشاء أو ضبطه اصطناعيًا عند فولتيات محددة.
ينظم المضخم مقدار التيار الذي يجب إضافته عبر القطب الفضي من أجل الحفاظ على ثبات الجهد.
بما أن القنوات الأيونية المختلفة المعتمدة على الجهد تفتح عند جهود محددة، فإن أحداث الفتح تُمثل من خلال التغيرات في مخططات القياسات¬ التيارات.
وبدلاً من ذلك، يمكن للعلماء تمرير تيار محدد قسراً عبر القطب الكهربائي وتسجيل التغيرات الناتجة في الجهد.يمكن تسجيل جهود الفعل في تكوين "مثبت التيار" (current clamp) هذا.
دعونا نستعرض الآن الأنواع الخمسة الرئيسية لتكوينات تثبيت الرقعة (patch clamp).
أولاً، تكوين الرقعة الملتصقة بالخلية (cell-attached)، حيث يتم سد الماصة الدقيقة ببساطة على غشاء خلية سليمة.
ثانياً، تكوين الخلية الكاملة (whole-cell)، حيث يتم تمزيق الغشاء الموجود داخل الماصة الدقيقة لإتاحة الوصول إلى الجزء الداخلي من الخلية.
ثالثاً، تكوين الرقعة المثقوبة (perforated patch). وهنا، تُضاف مواد كيميائية مثل المضادات الحيوية إلى الماصة الدقيقة لإحداث ثقوب صغيرة في الغشاء تتيح الوصول إلى العصارة الخلوية (cytosol).
التكوين الرابع هو الرقعة المقلوبة للداخل (inside-out patch). ولتحقيق ذلك، تُشكل الماصة الدقيقة أولاً سداً مع الخلية، ثم تُسحب بسرعة، مما يؤدي إلى نزع قطعة من الغشاء وتعريض السطح الداخلي لمحلول الحمام.
يسمح هذا بتعريض الجانب السيتوبلازمي للقنوات لمواد كيميائية مختلفة يتم إضافتها إلى الحمام.
وأخيراً، وبشكل مشابه للرقعة المقلوبة للداخل، تبدأ الرقعة المقلوبة للخارج (outside-out patch) كتكوين للخلية الكاملة. تُسحب الماصة الدقيقة ببطء حتى تشكل قطعة من الغشاء سداً محدباً عبر الطرف.
وفي هذا الإعداد، يمكن تعريض الوجه خارج الخلوي للقناة للمعالجات التجريبية.
بعد أن راجعنا المبادئ، دعونا نستعرض الخطوات المطلوبة لإجراء تسجيل تثبيت الرقعة (patch clamp).
ابدأ بسحب أنبوب زجاجي من البوروسيليكات لتحويله إلى ماصات دقيقة باستخدام جهاز سحب الماصات.
بعد ذلك، قم بتلميع الطرف بالصهر (fire polish) للحصول على القطر والمقاومة المناسبين.
بعد التلميع، املأ الماصة الدقيقة بمحلول أيوني وقم بنقرها برفق لإزالة أي فقاعات هوائية.
ثم مرر الماصة الدقيقة فوق القطب الكهربائي المثبت على حامل.
بمجرد التثبيت، استخدم حقنة لتطبيق ضغط إيجابي على الماصة، مما يمنع المحاليل الأخرى من الدخول إلى الطرف.
الآن، ضع الخلايا أو الأنسجة المستهدفة على منصة المجهر وحرك الماصة الدقيقة باتجاه الخلية.
أثناء قيام المضخم بتوليد نبضات جهد اختبارية، سجل المقاومة، والتي ستزداد بمجرد ملامسة الطرف للخلية.
لتكوين ختم الجيجا أوم (gigaohm seal)، قم بالتحويل برفق من الضغط الإيجابي إلى الضغط السلبي باستخدام الحقنة.سيؤدي تكوين الختم إلى زيادة سريعة في المقاومة لتصبح أكبر من 1 gigaohm.
بعد إنشاء تهيئة الخلية الملتصقة (cell-attached)، دعونا ننتقل إلى تهيئة الخلية الكاملة (whole-cell) ونقوم بإجراء تجربة!
تذكر أن تهيئة الخلية الكاملة تحدث عند تمزيق الغشاء.
يتم التمزيق عن طريق تسليط ضغط سلبي على الماصة الدقيقة (micropipette).
بمجرد تمزق الغشاء، سيظهر شكل نبضة الاختبار تيارات عابرة كبيرة، حيث يعمل غشاء الخلية الآن كمكثف يتم شحنه بواسطة نبضة الاختبار.
يمكن استقصاء خصائص نوع واحد من القنوات الأيونية في أي عصبون معين عن طريق تثبيط نشاط أنواع القنوات الأخرى دوائياً.
يُستخدم بروتوكول خطوة الجهد (voltage-step protocol) لفحص تيارات القنوات الأيونية التي يتم استثارتها عن طريق تغيير الجهد إلى سلسلة من جهود التثبيت المختلفة.
يوضح منحنى التيار-الجهد أو منحنى IV الاعتماد الجهدي للتيار المتدفق عبر القناة الأيونية، ويوفر رؤية حول الجهود التي تكون عندها القناة مفتوحة أو مغلقة.
لنلقِ نظرة الآن على بعض التطبيقات لاستكشاف ما يمكن لعلماء الأعصاب القيام به باستخدام هذه التقنية.
في بعض الأحيان، يمكن دراسة القنوات الأيونية الموجودة في العصبونات في بيئة غير خلوية.
هنا قام العلماء بإضافة بروتينات القنوات الأيونية إلى غشاء ليبيدي اصطناعي من أجل دراسة تلك القنوات بشكل منعزل.
يمكن بعد ذلك تعريض هذه القنوات لجزيئات تجريبية، مثل مادة capsaicin المستخلصة من الفلفل الحار، لدراسة تأثيرها على نشاط القناة.
وبما أنها معرضة للبيئة خارج الخلوية وتؤثر بشكل كبير على الوظيفة الخلوية، فإن القنوات الأيونية تمثل أهدافاً دوائية ممتازة. فعندما تُضاف المركبات المختبرة إلى الماصة الدقيقة أو محاليل الحمام، يمكن استخدام تسجيلات patch clamp لاختبار تأثير الأدوية، مثل النيكوتين، بشكل مباشر على النشاط العصبي. حتى أن مبدأ تطبيق الضغط السلبي لتكوين سدادة عالية المقاومة قد تم تطبيقه لإنشاء أجهزة عالية الإنتاجية، والتي يمكنها التسجيل من خلايا عديدة في آن واحد لتطبيقات فحص الأدوية.
يعد patch clamp للخلية الكاملة أداة قيمة لقياس استجابة الخلايا المفردة للمنبهات.
علاوة على ذلك، يمكن استخدام التسجيلات المزدوجة لاستقصاء تأثير إطلاق العصبونات على الخلايا المستهدفة القابلة للاستثارة، مثل العضلات. في هذا المثال، يُستخدم patch clamp للخلية الكاملة لتحفيز إطلاق عصبون حركي، بينما يتم في الوقت ذاته أخذ تسجيلات من الليفة العضلية التي يتحكم فيها. ويُلاحظ وجود علاقات واضحة بين الاستثارة العصبونية والنشاط العضلي.
لقد شاهدتم للتو مقدمة JoVE حول تسجيل تثبيت الرقعة (patch clamp recording)، حيث تمت مراجعة المبادئ الكامنة وراء هذه التقنية وخطوات إجراء التجربة.
بفضل حساسيتها الزمنية الفائقة للتغيرات في الجهد والتيارات، سيظل تسجيل تثبيت الرقعة أداة أساسية في فهم الفيزياء الحيوية للقنوات والخلايا العصبية.
شكراً للمشاهدة!
تسجيل الدخول أو للوصول إلى المحتوى الكامل. تعرّف على المزيد حول وصول مؤسستك إلى محتوى JoVE هنا
يعد تسجيل تثبيت الرقعة (Patch clamp) تقنية مفيدة للغاية لاستقصاء الخصائص الفيزيائية الحيوية للقنوات الأيونية التي تتحكم في التنشيط العصبي.
تتضمن هذه العملية ضغط أنبوبة مجهرية زجاجية ضد خلية ما لعزل "رقعة" صغيرة من الغشاء تحتوي على قناة أيونية واحدة أو أكثر.
ويسمح الإعداد التجريبي للعلماء كذلك بـ "تثبيت" البيئة الكهربائية للمنطقة المرقعة من خلال التحكم الدقيق في الجهد عبر غشاء الخلية، وهو ما يؤثر -بناءً على القنوات الأيونية الموجودة- على تدفق الأيونات عبر الغشاء ويتيح دراسة تفصيلية لهذه القنوات.
يقدم هذا الفيديو نظرة عامة على المبادئ التي تقوم عليها تقنية تثبيت الرقعة ، ووصفاً للخطوات اللازمة لإجراء التجربة، وأخيراً بعض تطبيقات هذه الطريقة.
أولاً، دعونا نراجع المبادئ الكامنة وراء تقنية الرقعة (patch) تسجيل تثبيت الجهد.
يختلف عدد الأيونات ذات الشحنة الموجبة والسالبة داخل العصبون عن عددها الموجود في الخارج.
يؤدي هذا الاختلال في التوازن إلى حدوث فرق في الجهد، أو ما يُعرف بجهد الغشاء، يبلغ حوالي -70 ملي فولت، مما يعني أن الشحنات في الداخل أكثر سلبية منها في الخارج.
تساعد القنوات الأيونية في الحفاظ على التدرج من خلال التحكم في حركة الأيونات عبر غشاء الخلية، والتي تمثل في الأساس تيارات كهربائية.
باستخدام تقنية تثبيت الرقعة (patch clamp)، يطرح العلماء تساؤلات حول طبيعة الجهد والتيار.
تتكون منصة تثبيت تثبيت الرقعة (patch clamp rig) من ماصّة زجاجية دقيقة، تحتوي على محلول أيوني وقطب فضة مكلورة لقياس الجهد والتيارات الكهربائية.
تحتوي طرف الماصة الدقيقة (micropipette) على فتحة مصقولة بقطر ميكرون واحد تحيط بمساحة صغيرة من الغشاء.
للقضاء على ضوضاء الخلفية الناتجة عن الأيونات الموجودة في محلول الحمام، يتم تكوين سدادة عالية المقاومة بين الماصة ورقعة الغشاء. وبما أن مقاومة هذه السدادة تقع في نطاق الجيجا أوم، فإنها تُعرف باسم سدادة الجيجا أوم.
يتصل القطب الموجود داخل الماصة بمضخم يمكنه تضخيم تقلبات التيار والجهد الناتجة عن حركة الأيونات عبر القنوات الموجودة في الغشاء البلازمي.
باستخدام المضخم، يستطيع العلماء تثبيت جهد الغشاء أو ضبطه اصطناعيًا عند فولتيات محددة.
ينظم المضخم مقدار التيار الذي يجب إضافته عبر القطب الفضي من أجل الحفاظ على ثبات الجهد.
بما أن القنوات الأيونية المختلفة المعتمدة على الجهد تفتح عند جهود محددة، فإن أحداث الفتح تُمثل من خلال التغيرات في مخططات القياسات¬ التيارات.
وبدلاً من ذلك، يمكن للعلماء تمرير تيار محدد قسراً عبر القطب الكهربائي وتسجيل التغيرات الناتجة في الجهد. يمكن تسجيل جهود الفعل في تكوين "مثبت التيار" (current clamp) هذا.
دعونا نستعرض الآن الأنواع الخمسة الرئيسية لتكوينات تثبيت الرقعة (patch clamp).
أولاً، تكوين الرقعة الملتصقة بالخلية (cell-attached)، حيث يتم سد الماصة الدقيقة ببساطة على غشاء خلية سليمة.
ثانياً، تكوين الخلية الكاملة (whole-cell)، حيث يتم تمزيق الغشاء الموجود داخل الماصة الدقيقة لإتاحة الوصول إلى الجزء الداخلي من الخلية.
ثالثاً، تكوين الرقعة المثقوبة (perforated patch). وهنا، تُضاف مواد كيميائية مثل المضادات الحيوية إلى الماصة الدقيقة لإحداث ثقوب صغيرة في الغشاء تتيح الوصول إلى العصارة الخلوية (cytosol).
التكوين الرابع هو الرقعة المقلوبة للداخل (inside-out patch). ولتحقيق ذلك، تُشكل الماصة الدقيقة أولاً سداً مع الخلية، ثم تُسحب بسرعة، مما يؤدي إلى نزع قطعة من الغشاء وتعريض السطح الداخلي لمحلول الحمام.
يسمح هذا بتعريض الجانب السيتوبلازمي للقنوات لمواد كيميائية مختلفة يتم إضافتها إلى الحمام.
وأخيراً، وبشكل مشابه للرقعة المقلوبة للداخل، تبدأ الرقعة المقلوبة للخارج (outside-out patch) كتكوين للخلية الكاملة. تُسحب الماصة الدقيقة ببطء حتى تشكل قطعة من الغشاء سداً محدباً عبر الطرف.
وفي هذا الإعداد، يمكن تعريض الوجه خارج الخلوي للقناة للمعالجات التجريبية.
بعد أن راجعنا المبادئ، دعونا نستعرض الخطوات المطلوبة لإجراء تسجيل تثبيت الرقعة (patch clamp).
ابدأ بسحب أنبوب زجاجي من البوروسيليكات لتحويله إلى ماصات دقيقة باستخدام جهاز سحب الماصات.
بعد ذلك، قم بتلميع الطرف بالصهر (fire polish) للحصول على القطر والمقاومة المناسبين.
بعد التلميع، املأ الماصة الدقيقة بمحلول أيوني وقم بنقرها برفق لإزالة أي فقاعات هوائية.
ثم مرر الماصة الدقيقة فوق القطب الكهربائي المثبت على حامل.
بمجرد التثبيت، استخدم حقنة لتطبيق ضغط إيجابي على الماصة، مما يمنع المحاليل الأخرى من الدخول إلى الطرف.
الآن، ضع الخلايا أو الأنسجة المستهدفة على منصة المجهر وحرك الماصة الدقيقة باتجاه الخلية.
أثناء قيام المضخم بتوليد نبضات جهد اختبارية، سجل المقاومة، والتي ستزداد بمجرد ملامسة الطرف للخلية.
لتكوين ختم الجيجا أوم (gigaohm seal)، قم بالتحويل برفق من الضغط الإيجابي إلى الضغط السلبي باستخدام الحقنة. سيؤدي تكوين الختم إلى زيادة سريعة في المقاومة لتصبح أكبر من 1 gigaohm.
بعد إنشاء تهيئة الخلية الملتصقة (cell-attached)، دعونا ننتقل إلى تهيئة الخلية الكاملة (whole-cell) ونقوم بإجراء تجربة!
تذكر أن تهيئة الخلية الكاملة تحدث عند تمزيق الغشاء.
يتم التمزيق عن طريق تسليط ضغط سلبي على الماصة الدقيقة (micropipette).
بمجرد تمزق الغشاء، سيظهر شكل نبضة الاختبار تيارات عابرة كبيرة، حيث يعمل غشاء الخلية الآن كمكثف يتم شحنه بواسطة نبضة الاختبار.
يمكن استقصاء خصائص نوع واحد من القنوات الأيونية في أي عصبون معين عن طريق تثبيط نشاط أنواع القنوات الأخرى دوائياً.
يُستخدم بروتوكول خطوة الجهد (voltage-step protocol) لفحص تيارات القنوات الأيونية التي يتم استثارتها عن طريق تغيير الجهد إلى سلسلة من جهود التثبيت المختلفة.
يوضح منحنى التيار-الجهد أو منحنى IV الاعتماد الجهدي للتيار المتدفق عبر القناة الأيونية، ويوفر رؤية حول الجهود التي تكون عندها القناة مفتوحة أو مغلقة.
لنلقِ نظرة الآن على بعض التطبيقات لاستكشاف ما يمكن لعلماء الأعصاب القيام به باستخدام هذه التقنية.
في بعض الأحيان، يمكن دراسة القنوات الأيونية الموجودة في العصبونات في بيئة غير خلوية.
هنا قام العلماء بإضافة بروتينات القنوات الأيونية إلى غشاء ليبيدي اصطناعي من أجل دراسة تلك القنوات بشكل منعزل.
يمكن بعد ذلك تعريض هذه القنوات لجزيئات تجريبية، مثل مادة capsaicin المستخلصة من الفلفل الحار، لدراسة تأثيرها على نشاط القناة.
وبما أنها معرضة للبيئة خارج الخلوية وتؤثر بشكل كبير على الوظيفة الخلوية، فإن القنوات الأيونية تمثل أهدافاً دوائية ممتازة. فعندما تُضاف المركبات المختبرة إلى الماصة الدقيقة أو محاليل الحمام، يمكن استخدام تسجيلات patch clamp لاختبار تأثير الأدوية، مثل النيكوتين، بشكل مباشر على النشاط العصبي. حتى أن مبدأ تطبيق الضغط السلبي لتكوين سدادة عالية المقاومة قد تم تطبيقه لإنشاء أجهزة عالية الإنتاجية، والتي يمكنها التسجيل من خلايا عديدة في آن واحد لتطبيقات فحص الأدوية.
يعد patch clamp للخلية الكاملة أداة قيمة لقياس استجابة الخلايا المفردة للمنبهات.
علاوة على ذلك، يمكن استخدام التسجيلات المزدوجة لاستقصاء تأثير إطلاق العصبونات على الخلايا المستهدفة القابلة للاستثارة، مثل العضلات. في هذا المثال، يُستخدم patch clamp للخلية الكاملة لتحفيز إطلاق عصبون حركي، بينما يتم في الوقت ذاته أخذ تسجيلات من الليفة العضلية التي يتحكم فيها. ويُلاحظ وجود علاقات واضحة بين الاستثارة العصبونية والنشاط العضلي.
لقد شاهدتم للتو مقدمة JoVE حول تسجيل تثبيت الرقعة (patch clamp recording)، حيث تمت مراجعة المبادئ الكامنة وراء هذه التقنية وخطوات إجراء التجربة.
بفضل حساسيتها الزمنية الفائقة للتغيرات في الجهد والتيارات، سيظل تسجيل تثبيت الرقعة أداة أساسية في فهم الفيزياء الحيوية للقنوات والخلايا العصبية.
شكراً للمشاهدة!
View the full transcript and gain access to JoVE Science Education videos
Q1: What is the basic principle behind patch clamp recording?
Patch clamp recording isolates a small membrane patch containing ion channels by pressing a glass micropipette against a cell and forming a high-resistance seal. Scientists then use an electrode to clamp or control the electrical environment of the patched area, allowing precise measurement of how voltage changes affect ion flow through channels. This technique reveals the biophysical properties of ion channels that regulate neuronal activation.
Q2: How does a gigaohm seal form in patch clamp experiments?
A gigaohm seal forms when negative pressure is applied through a syringe to the micropipette, creating a high-resistance seal between the pipette tip and the cell membrane. The resistance increases rapidly to greater than 1 gigaohm, effectively isolating the membrane patch from background noise in the bath solution. This seal is critical for detecting small electrical currents from individual ion channels.
Q3: What are the main differences between whole-cell and cell-attached patch configurations?
In cell-attached configuration, the micropipette simply seals to an intact cell membrane, allowing study of channels in their native state. Whole-cell configuration ruptures the membrane within the micropipette to access the cell's interior, enabling measurement of total cellular currents. Whole-cell recording provides broader access to intracellular mechanisms and is commonly used for voltage-step protocols and current-voltage curve generation.
Q4: How does inside-out patch configuration expose the cytoplasmic side of ion channels?
Inside-out patch begins with a cell-attached seal, then the micropipette is pulled back quickly, ripping a piece of membrane away from the cell. This exposes the cytoplasmic surface of the channels to the bath solution, allowing researchers to apply experimental chemicals directly to the intracellular face of ion channels. This configuration is valuable for studying how cytoplasmic factors regulate channel activity.
Q5: What does a current-voltage curve reveal about ion channel function?
A current-voltage (IV) curve shows the voltage-dependence of current flowing through an ion channel, revealing at which voltages the channel opens or closes. Generated using a voltage-step protocol that steps the membrane potential through a series of different holding potentials, the IV curve provides insight into channel kinetics and selectivity. This data is essential for understanding how voltage-gated ion channels control neuronal excitability.
Q6: How is patch clamp recording used for drug screening and testing?
Test compounds can be added to the micropipette or bath solutions during patch clamp recording to directly measure drug effects on neural activity. For example, nicotine or other neuroactive compounds are applied while recording channel currents, revealing how drugs alter ion channel function. High-throughput devices based on the gigaohm seal principle now enable simultaneous recording from numerous cells for rapid drug screening applications.
Q7: What can paired whole-cell patch clamp recordings demonstrate about neuron-muscle interactions?
Paired recordings simultaneously stimulate firing of a motor neuron while recording responses from the muscle fiber it controls, revealing direct relationships between neuronal excitation and muscle activity. This approach, using primary neuronal cultures and electrophysiology techniques, demonstrates how action potentials in neurons translate into functional responses in target cells. Such experiments are crucial for understanding synaptic transmission and neuromuscular function.