الفحص النمو القائم على مراسل لتحليل منهجي من تدهور البروتين

الهدف العام من هذا الإجراء هو تحديد الاختلافات في معدلات تحلل البروتين بطريقة منهجية عن طريق ربطها بحركية نمو الخميرة في الثقافة السائلة. يتم تحقيق ذلك من خلال الخلايا النامية الأولى التي تعبر عن بروتين مراسل يتكون من إشارة تحلل مقترنة بعلامة التمثيل الغذائي بين عشية وضحاها إلى المرحلة الثابتة في وسط انتقائي مناسب. بعد ذلك ، يتم قياس الكثافة البصرية للخلايا لتحديد حركية نمو الخلايا ، ثم يتم حساب الحد الأدنى لوقت مضاعفة الخلايا أثناء مرحلة السجل من حركية النمو باستخدام برنامج معين.

في النهاية ، يمكن استخدام الحد الأدنى لوقت المضاعفة المحسوب لتحديد الاختلافات في حركية تحلل البروتين. أضافت المزايا الرئيسية لهذه التقنية على الطرق الحالية مثل فحوصات تحلل السيكلامات أو مطاردة النبض أن تقنيتنا سهلة الإعداد. الحصول على البيانات وتحليلها مباشران ، وتصميم المقال معياري للغاية.

يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال تدهور الوعاء ، مثل العناصر المطلوبة للتعرف على الأواني غير المطوية بواسطة نظام وعاء يوبيكويتين. خطرت لي فكرة هذه الطريقة لأول مرة عندما أردت عمل شاشة لتحديد البروتينات التي تنطوي على إزالة اليوبيكويتين من مجموعتها الفرعية. لذلك أنشأت طريقة بسيطة لمقارنة عينات متعددة لإعداد الخلايا للتحليل.

ابدأ بتحويل خلايا الخميرة الضمورية المناسبة للثور مثل TRY 4 67 مع بلازميد يحتوي على اندماج U three Deron وعلامة استقلابية إضافية لاختيار البلازميد وصيانته. لاختيار البلازميد وصيانته ، قم بزراعة الخلايا على ألواح أجار تحت وسط اصطناعي محدد مناسب ، تفتقر إلى علامات اختيار الأحماض الأمينية ، ونقل المستعمرات الباقية إلى بقع ، ونقل الخلايا من البقع إلى وسائط سائلة واحتضانها طوال الليل عند 30 درجة مئوية حتى الوصول إلى مرحلة ثابتة. ثم بالنسبة ل 15 عينة أو أقل ، قم بتخفيف 50 ميكرولترا من الخلايا من المزرعة الليلية باستخدام 150 ميكرولترا من الوسط الاصطناعي المحدد لكل بئر.

في صفيحة بئر 96 قاضية شفافة ، استخدم قارئ صفيحة دقيقة لتحديد قيم OD 600 للعينات. ثم بعد حساب الحجم الدقيق اللازم للحصول على خلايا الخميرة بكمية تعادل OD 600 من 0.25 ، قم بتدوير الخلايا لمدة دقيقة واحدة عند 12 ، 000 مرة G ودرجة حرارة الغرفة ، قم بتعليق الخلايا في مليلتر واحد من الوسط الانتقائي المناسب للحصول على OD 600 من 0.25 ونقل 200 ميكرولتر من السلالة المخففة إلى بئر واحد من لوحة بئر 96 جديدة عندما تكون أكبر من 15 يجب اختبار العينات. انقل 10 ميكرولترات من الخلايا الثابتة المزروعة بين عشية وضحاها إلى بئر واحد من صفيحة بئر جديدة 96 تحتوي على 190 ميكرولترا من الوسائط الانتقائية المناسبة لقياس حركية نمو خلايا الخميرة المحولة في ظل ظروف انتقائية.

بعد ذلك ، اضبط قارئ الصفيحة الدقيقة متعدد الأوضاع على درجة حرارة حضانة تبلغ 30 درجة مئوية OD 600 فواصل قياس تبلغ 15 دقيقة ودورات اهتزاز مدارية وخطية مدتها دقيقة واحدة كل سبع دقائق. ثم احتضان الخلايا عند 30 درجة مئوية في قارئ Microplate لمدة 12 إلى 24 ساعة. عندما تصل الخلايا إلى المرحلة الثابتة ، قم بتصدير البيانات الأولية إلى ملف جدول بيانات لتحديد حركية نمو الخميرة باستخدام MDT Calc.

تأكد من حفظ ملف جدول البيانات الذي يحتوي على بيانات النمو وإغلاقه. ثم افتح برنامج تطبيق MDT Calc ضمن مسار الملف. انقر فوق المستطيل لتحديد موقع ملف جدول البيانات أسفل اسم الورقة.

أدخل اسم جدول البيانات حيث توجد البيانات الأولية ضمن موضع البداية. أدخل إحداثيات جدول البيانات للوقت ، صفر العينة الأولى ضمن عمود الوقت. أدخل الحرف الذي يحدد موقع عمود النقطة الزمنية بالثواني أسفل العمود الفارغ ، أدخل الحرف الذي يحدد موقع العمود الفارغ.

على سبيل المثال ، بئر واحد من لوحة البئر 96. مقبل. تحت قيمة OD ، أختر الحد الأدنى من قيمة OD 600 المحولة المطلوبة لبدء حساب MDT. عادة ما يكون من 0.15 إلى 0.25 للتأكد من أن MDT يتم حسابه فقط للعينات التي تصل إلى قيمة D 600 المحددة أو أعلى.

بمجرد إدخال القيمة الأخيرة ، انقر فوق الزر حساب وتأكد من أن شريط التقدم الموجود على اليمين يتغير تدريجيا إلى اللون الأخضر. أخيرا ، قم بتصدير مجموعتي البيانات اللتين تظهران تلقائيا على الشاشة عند الانتهاء من حساب MDT إلى جدول بيانات جديد. تأكد من أن البيانات تتضمن قيمة MDT لكل بئر يجتاز اختبار الحد الأدنى لقيمة OD ووقت بدء الفاصل الزمني الذي تم من خلاله حساب MDT في هذه التجربة التمثيلية.

تمت مقارنة الاختلافات النسبية في حركية تحلل البروتين بين النوع البري والسلالات الطافرة المختلفة في البداية من النوع البري U BBC six أو دلتا UBC سبعة دلتا أو خلايا دلتا DOA 10 التي تعبر عن D واحد VMAU ثلاثة نمت على وسط كامل محدد اصطناعي. ثم لقياس الخياشيم ، تم غسل الخلايا واحتضانها في وسائط اصطناعية محددة. لوحظ منحنيات نمو مماثلة ناقص يوراسيل و MDT محسوبة لجميع السلالات المزروعة في وسط كامل محدد اصطناعي ، باستثناء احتمال أن يؤثر حذف أي من الجينات التي تم فحصها على نمو الخلايا.

في المقابل ، أدى الحضانة في الوسائط الاصطناعية المحددة مطروحا منها اليوراسيل إلى ضعف نمو الخلايا البرية ، بينما لوحظ عيب طفيف في النمو في السلالات الطافرة. UBC سبعة مطلوب تماما ل DEG واحد VMAU ثلاثة تحلل مما يتيح تقييما دقيقا حتى للتأثيرات الجزئية لمختلف طفرات E اثنين. وفقا لذلك ، لوحظت حركية النمو السريع في الخلايا التي تعبر عن UBC سبعة مع طفرات الموقع النشط ، C 89 s و N 81 A.In بالإضافة إلى ذلك ، كما تم العثور على اثنين من الطفرات التي يتوقع أن يعيقا بشكل غير مباشر DEG واحد VMA ETH ثلاثة تدهور V 20 5G و H 90 4K لتعزيز نمو الخلايا مقارنة بالنوع البري UBC سبعة ، وإن كان ذلك بدرجة أقل من طفرات الموقع النشطة.

وبالتالي ، يمكن استخدام طريقة الخياشيم للقياس الدقيق للمساهمة النسبية لعوامل التحلل المختلفة في استقرار ركيزة المراسل. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر أن البروتوكول حساس للاختلافات الصغيرة في معدلات تحلل البروتين. هذه ميزة ، لكنها تعني أيضا أنه يجب توخي الحذر في تصميم Deron والتحقق منه لاستخدامه باتباع هذا الإجراء.

يمكن إجراء طرق أخرى مثل الفحص المجهري الفلوري عالي الإنتاجية للإجابة على أسئلة إضافية مثل ما هو ميل تجميع بروتينات المراسل. لهذا السبب ، من الجيد أيضا تضمين علامة GFP في المراسل. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تحديد التغييرات في معدل تحلل البروتين بطريقة منهجية باستخدام قارئ MICROPLATE وبرنامجنا المخصص