وتحليل وعائية عصبية إعادة عرض في Entorhino-الحصين الثقافات شريحة عضوي النمط

بروتوكول للثقافات شريحة عضوي النمط-entorhino الحصين، والذي يسمح استنساخ جوانب كثيرة من إصابات الدماغ الدماغية، ويرد. من خلال دراسة التغيرات في neurovasculature بالإضافة إلى التغييرات في الخلايا العصبية، وهذا البروتوكول هو أداة مرنة لدراسة التغيرات البلاستيك في الأنسجة العصبية بعد الإصابة.

الهدف العام من هذا الإجراء هو دراسة التغيرات في الخلايا العصبية والأوعية الدموية في وقت واحد في نموذج زراعة الأنسجة لإصابة الدماغ الإقفارية. يتم تحقيق ذلك عن طريق إنشاء ثقافات شرائح الحصين الأولى لدخول وحيد القرن الخطوة الثانية هي تقليد إصابات الدماغ الإقفارية عن طريق تعريض الثقافات لظروف نقص الأكسجة.

الخطوة الأخيرة هي تحليل وربط بقاء الخلايا العصبية وتغيرات الأوعية الدموية. في النهاية ، يتم استخدام نهج في المختبر يعتمد على مزارع شرائح الحصين العضوية لإظهار التفاعلات المعقدة بين الخلايا العصبية والأوعية الدموية في ظل الظروف الإقفارية. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنه بعد تحدي نقص الأكسجين ، يمكن دراسة بقاء الخلايا العصبية وتغيرات الأوعية الدموية في وقت واحد في نظام نموذج زراعة الشرائح.

يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال نقص التروية العصبي ، مثل الكشف عن التفاعلات المعقدة بين الخلايا العصبية والأوعية الدموية والظروف الإقفارية. للبدء ، الاستعداد ، أدخل مزارع شرائح النمط العضوي في الحصين وحيد القرن من يوم ما بعد الولادة من الملوثات العضوية الثابتة للفأر. بعد إزالة الجمجمة ، حدد الشق بين الطرف الحري لنصفي الكرة المخية والدماغ المتوسط.

قم بإزالة أجزاء الدماغ المنقارية بعناية إلى الدماغ الأوسط وضعها في وسط تحضير مثلج يتكون من MEM مكمل. استمر في التشريح تحت مجهر ستيريو ، مع إبقاء الدماغ مغمورا في وسط تحضير الجليد. إزالة السحايا المتبقية من نصفي الكرة القشرية.

بعد ذلك ، حدد الحصين عند السطح الحري الإنسي لنصف الكرة الأرضية ، وافصله مع قشرة الرطوبة النسبية المجاورة عن بقية الدماغ. انقل الأنسجة إلى مفرمة الأنسجة وقم بقطع شرائح بسمك 400 ميكرون عرضية إلى المحور الصدغي الحاجز للحصين. ضع الشرائح على إدخالات زراعة الخلايا واحتضانها في ستة أطباق بئر مع ملليلتر واحد من وسط الحضانة في جو رطب.

قم بتغيير الوسيط في اليوم التالي ثم كل يومين حتى أسبوع واحد بعد ذلك ، قم بإعداد وسيط OGD. أضف ملليلتر واحد من وسط OGD إلى كل بئر من اثنين ستة. تعمل ألواح زراعة أنسجة الآبار على نفخ وسط OGG بالنيتروجين لمدة ساعة واحدة في غرفة نقص الأكسجة ، وقبل إغلاقها وتخزينها طوال الليل في حاضنة عند 37 درجة مئوية ، استخدم الشرائط اللاهوائية كمؤشرات لنقص الأكسجة.

ضع في اعتبارك أن الوسط خال من الأكسجين عندما يتغير لون الشرائط من اللون الوردي إلى الأبيض. عندما تصبح جاهزا ، حدد الخلايا السليمة عن طريق تلطيخ يوديد البروبيديوم أو PI. أضف باي لمدة 30 دقيقة إلى وسط المزرعة بتركيز ميكروغرامين لكل ملليلتر.

شاهد الثقافات الحية باستخدام مجهر مقلوب مزود ببصريات مضان فقط. يجب اختيار الشرائح التي تحتوي على عدد قليل من الخلايا المسماة كما هو موضح هنا لمزيد من الدراسات مع العديد من الخلايا المسماة كما هو موضح هنا. لا ينبغي استخدامه لتحريض OGD.

انقل الشرائح إلى وسط OGD واحتفظ بها لمدة 15 دقيقة في غرفة نقص الأكسجة ، وتأكد من أن جميع السوائل المتبقية على جانبي الملحق يتم شفاقتها بعيدا عن مزارع التبديل. من الوسط العادي إلى وسط OGD والعودة بعد OGD ، استبدل وسط OGD بوسط خال من المصل المؤكسج واسمح للمزارع بالتعافي لمدة 3 أو 24 أو 48 ساعة. في وسط خال من المصل ، أضف pi مرة أخرى قبل التثبيت لتحديد موت الخلايا.

إذا كانت الدراسة تتطلب علاجات دوائية ، فابدأ إما أثناء اضطراب الوسوجاعات أو مباشرة بعد نقل الشرائح إلى مصل خال. متوسط لتلوين PI. بالاقتران مع الكيمياء المناعية ، أضف محلول PI قبل 30 دقيقة من تثبيت الثقافات.

بعد تثبيت الخلايا طوال الليل ، قم بإزالة محلول PFA وغسل الشرائح ثلاث إلى أربع مرات. باستخدام PBS ، ابدأ إجراء الحجب عن طريق فصل الشرائح بعناية عن إدخالات الثقافة ونقلها إلى بئر من 96 صفيحة بئر مملوءة بمخزن مؤقت للحظر. احتفظ بالشرائح في المخزن المؤقت للحجب لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة تحت تحريض مستمر بواسطة شاكر مداري.

بعد إضافة الأجسام المضادة الأولية المفضلة ، احتضن لمدة 48 ساعة عند أربع درجات مئوية مع تحريك مستمر بعد فترة الحضانة. اغسلها في PBS مع 0.5٪ Triton X 103 إلى أربع مرات. بعد ذلك ، اتبع الإجراءات القياسية في جميع أنحاء الجسم المضاد الثانوي قبل تركيب أقسام البقع على شرائح زجاجية مع زلات غطاء.

اعرض الشرائح الملطخة إما على مجهر قياسي باستخدام معدات مضان epi أو باستخدام مجهر متحد البؤر. بالنسبة لبعض الصور ، اقلب تباين التألق من أجل إنتاج أوعية ملطخة داكنة على خلفية ساطعة باستخدام شرائح ملطخة بطبقة من اللامينين. صور مسجلة متراكبة لتكبير 10 × مع تراكب شبكي ستة × ستة ثلاث شبكات من هذا القبيل في منطقة ca one و CA three DG و DC.

وعد السفن التي تعبر خطوط الشبكة للحصول على نتائج ذات أهمية إحصائية جيدة. خذ قياسات من ثلاث تجارب مستقلة على الأقل ، كل منها بما في ذلك بيانات من ثلاث نفخات فأر مع ثلاث شرائح لكل جرو فأر. تكشف مقارنة ثقافات التحكم مع المعالجة أن نقص الأكسجة يؤدي إلى موت الخلايا العصبية وفقدان الأوعية الدموية في منطقة واحدة من الحصين.

في هذه الأمثلة ، يظهر تلطيخ PI باللون الأحمر ومدمج مع تلطيخ اللامينين باللون الأخضر بعد ثلاث ساعات من علاج نقص الأكسجة ، ولا يوجد تلطيخ PI مرئي ولا توجد تغييرات في الأوعية الدموية واضحة. بعد 24 ساعة يظهر تلطيخ PI ويكون فقدان الأوعية الدموية واضحا أيضا. يصبح كل من تلطيخ PI وفقدان الأوعية الدموية أكثر وضوحا بعد 48 ساعة.

يؤدي OGD وحده إلى فقدان الخلايا العصبية وفقدان الأوعية الدموية. في كاليفورنيا ، منع تطبيق واحد من TTX أو CN QX فقدان الخلايا العصبية كما رأينا مع تلطيخ PI وفقدان الأوعية الدموية الذي تم الكشف عنه عن طريق علاج تلطيخ اللامينين ب 100 ميكرومولار A MPA لمدة 30 دقيقة تسبب في فقدان الخلايا العصبية على نطاق واسع في معظم المناطق في الحصين ، لكن فقدان الأوعية الدموية ظل مقصورا على المنطقة CA الأولى. يؤكد القياس الكمي للأوعية الدموية الخسارة الانتقائية في منطقة CA واحدة.

بعد هذا الإجراء ، يمكن إجراء علاجات دوائية أو تعديلات جينية لتحديد عوامل الحماية العصبية الفعالة وفهم آليات إعادة تشكيل الأوعية الدموية بشكل أفضل. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إعداد الحصين المتداخل مثل الثقافات ، والحث على OGD متبوعا بتحليل كل من بقاء الخلايا العصبية وتغيرات الأوعية الدموية.