طرق الخلية المرفقة قياسات السعة في ماوس الكظرية أليف الكروم خلية

الهدف العام من هذا الإجراء هو الكشف عن الحويصلة المفردة والخلوية والالتقام الخلوي. يتم تحقيق ذلك عن طريق الحصول أولا على هضم نظيف وكامل لأنسجة الغدة الكظرية في الفأر. الخطوة الثانية هي فصل الخلايا وصفيحة الغدد الكظرية.

بعد ذلك ، يتم تحديد خلايا الكرومين وتثبيتها للحصول على تسجيلات السعة المرفقة بالخلية. في النهاية ، يمكن ملاحظة الحويصلة المفردة والخلوية والالتقام الخلوي. الميزة الرئيسية لهذه التقنية على الطرق الحالية مثل التسجيلات المرتبطة بالخلايا للقنوات الأيونية المفردة ، هي أننا قادرون على اكتشاف إفراز الخلايا والالتقام الخلوي للحويصلات المفردة.

العرض المرئي لهذه الطريقة مفيدا حيث يصعب تعلم الحصول على ختم جيجا. أيضا ، قد يكون من الصعب تحديد الخلايا بين أنواع الخلايا المختلطة الموجودة داخل اللوحة. للتحضير للجراحة ، ابدأ بتعقيم زوج من التشريح الكبير والصغير والمقص وزوجين من الملقط.

ثم ضع صينية التشريح على دلو ثلج. ابدأ أيضا في غلي محلول الإنزيم بنسبة 5٪ من ثاني أكسيد الكربون و 95٪ من الأكسجين. الحل وردي فاتح قبل الفقاعات. مقبل.

بعد القتل الرحيم وقطع رأس فأر حديث الولادة إلى ثلاثة أيام ، استخدم مجموعة المقص الأصغر لقطع الجزء الخلفي من الجرو بعد العمود الفقري من عنق الرحم إلى منطقة الكورد. تأكد من القطع بشكل سطحي تحت الجلد لتجنب ثقب تجويف الجسم. بعد ذلك ، قشر الجلد بعيدا عن العمود الفقري حتى تتعرض العضلات ويكون هناك رؤية واضحة للعمود الفقري.

الآن قم بعمل قطع مقطعي عبر الحبل الشوكي العنقي ثم قم بعمل قطعتين متوازيتين على طول جانبي العمود الفقري باستخدام زوج واحد من الملقط الذي يحمل الجسم الرئيسي للحيوان. استخدم الزوج الآخر من الملقط للإمساك بالعمود الفقري وتقشير العمود الفقري حتى تنكشف الكلى. بعد تحديد موقع الغدد الكظرية أعلى الكلى ، استخدم الملقط لإزالتها.

ثم ضع الغدد الكظرية بعناية في أنبوب مخروطي مملوء بمحلول قفل. استخدم زوجا ثانيا من الملقط لإخراج الغدد الكظرية. إذا التزموا بالزوج الأول من الملقط ، ضع الأنبوب المخروطي على الجليد.

يمكن الاحتفاظ بالغدد في محلول قفل لمدة تصل إلى ساعتين. في هذه المرحلة ، تحقق من محلول الإنزيم للتأكد من أن المحلول المتوازن قد تحول من اللون الوردي الفاتح إلى اللون البرتقالي الوردي. بعد ذلك ، أضف pape إلى محلول الإنزيم الفقاعي حديثا بتركيز نهائي من 20 إلى 25 وحدة لكل مليلتر.

ثم أضف محلول إنزيم البروبان إلى أنبوب مخروطي جديد واستخدم الملقط لنقل الغدد الكظرية إلى أنبوب إنزيم البروبان. احتضان الغدد لمدة 40 إلى 60 دقيقة عند 37 درجة مئوية. ثم أضف 75٪ من محلول التعطيل إلى كل أنبوب واحتضنه عند 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق أخرى.

بعد 10 دقائق ، انقل الغدد برفق إلى أنبوب مسمى حديثا واغسل الغدد ثلاث مرات باستخدام وسائط الاستزراع. بعد الغسيل، ضع الغدد في 200 ميكرولتر من وسط الاستزراع، ثم قم بمعايرة الغدد برفق لأعلى ولأسفل من خلال طرف الماصة لماصة سعة 200 ميكرولتر. عند المعايرة بالتحليل الحجمي، حافظ على الغدد الموجودة في الجزء السفلي من الأنبوب بالقوة الهابطة من طرف الماصة سعة 200 ميكرولتر وقم بإشراك الأنسجة برفق وببطء تأكد من استخدام ضربات بطيئة ومستمرة، ولا تسحب العينة بسرعة أو فجأة بعد المعايرة بالتحليل الحجمي، وأضف 250 ميكرولترا إضافيا من وسائط الاستزراع ليصل الحجم الإجمالي لوسائط الاستزراع إلى 450 ميكرولترا.

في المرتبة التالية ، تنزلق سبعة غطاء مطلي مسبقا PDL مقاس 12 ملم في صفيحة صحن ثقافة مقاس 60 × 50 ملم. ثم ضع 60 ميكرولترا من الخلية التي تحتوي على محلول على كل من زلات الغطاء السبعة. بمجرد طلاءه ، ضع الطبق في الحاضنة على حرارة 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.

بعد الحضانة ، أضف برفق خمسة ملليلتر من وسائط الثقافة الدافئة إلى طبق الاستزراع ، ثم احتضنه لمدة 24 ساعة قبل إجراء التسجيلات المرفقة بالخلايا. بعد مكان الحضانة ، ينزلق غطاء الغطاء 12 ملم الذي يحتوي على خلايا الغدة الكظرية في محلول خارج الخلية. نظرا لاستخدام الغدد الكظرية بأكملها ، فإن الخطوة التالية هي التفريق بين خلايا الكرومين والخلايا القشرية.

في الثقافة ، عادة ما تكون خلايا الكرومين مشرقة جدا مع لون بيج بني وشكل دائري شبه مثالي. في المقابل ، تكون الخلايا القشرية أصغر حجما وأكثر باهتا من خلايا CHRO. بعد سحب ماصات التصحيح كما هو موضح في بروتوكول النص، اغمس طرف الماصة في الشمع المذاب لتقليل سعة الزجاج.

ثم قم بتلميع الطرف بالنار لتفجير هذا الشمع من داخل طرف الماصة. بعد ذلك، قم ببناء الماصة بمحلول الماصة الرقعة بحيث تكون مقاومتها حوالي اثنين من الميجا أوم. قم بتوصيل ماصة التصحيح بمناورها وجعلها في حدود عدة ميكرونات من الخلية.

استمر في دفع الماصة بحثا عن أي تشوه طفيف في الخلية. بمجرد اكتشاف التشوه ، قم بتطبيق شفط لطيف حتى يتم الحصول على ختم جيجا أوم. إنتاج تكوين مرفق للخلية.

بمجرد الكشف عن ختم جيجا أم ، قم بعمل تسجيلات متصلة بالخلية من خلال استخدام مضخم مشبك EPC سبعة زائد ، ومكبر للصوت تناظري ثنائي الطور كما هو موضح في بروتوكول النص ، اضبط مرحلة مضخم القفل ، بحيث تتغير السعة العابرة الناتجة عن الشفط اللطيف. تظهر النبضات فقط في سعة التصحيح ، أو تتبع Im بدون إسقاط في الرقعة أو التوصيل أو تتبع عملية الترقيع بمثابة تحفيز ميكانيكي. نظرا لأنه يمكن تسجيل تيار الفعل عادة من معظم الخلايا ، حدد تغييرات السعة النموذجية من خلال الخطوة الهبوطية المحددة.

الخطوة الأخيرة هي حفظ البيانات لتحليلها في المستقبل. يظهر هنا تسجيل سعة نموذجي متصل بالخلية بخطوات هبوطية متعددة. ترتبط كل خطوة هبوطية بخلوي iCal واحد.

بمجرد إتقانها ، يمكن إكمال زراعة الخلايا في غضون ساعتين إلى ثلاث ساعات ، ويمكن إجراء التسجيلات في غضون الأيام الأربعة التالية بعد تطورها. مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال النقل المشبكي لاستكشاف إعادة تدوير الحويصلة المشبكية في خلايا الكرومين العصبية الصماء.