تصوير الكالسيوم في الخلايا العصبية

يُعد تصوير الكالسيوم تقنية مفيدة للغاية لاستقصاء الأدوار المتنوعة التي تؤديها أيونات الكالسيوم في عمل الخلايا العصبية. تولد أيونات الكالسيوم مجموعة كبيرة من الإشارات داخل الخلوية التي تتحكم في وظائف رئيسية، مثل تحرر الناقلات العصبية من الحويصلات التشابكية. تتيح طرق تصوير الكالسيوم القياس المباشر لتدفق الكالسيوم الديناميكي داخل الخلايا العصبية والأنسجة العصبية. يقدم هذا الفيديو نظرة عامة على كيفية عمل صبغات مؤشرات الكالسيوم، وكيفية إتمام تجربة تصوير الكالسيوم، وفي الختام يناقش بعض تطبيقات هذه التقنية.

أولاً، دعونا نراجع المبادئ البيوكيميائية لصبغات مؤشرات الكالسيوم.

صبغات مؤشرات الكالسيوم هي جزيئات مخلبية معدلة، مثل Fura-2، وتتكون من مكونين رئيسيين. الأول هو موقع المخلب الذي يرتبط بالكالسيوم بطريقة اختيارية. والثاني هو موقع فلوري يبعث ضوءاً بطول موجي محدد عند إضاءته بطول موجي لإثارة من الأشعة فوق البنفسجية.

يؤدي ارتباط الكالسيوم بالصبغة إلى تغيير خصائص الفلورة الخاصة بها، مما يوفر وسيلة لقياس التغيرات في تركيز الكالسيوم، والتي تُمثَّل هنا بالفرق في شدة الفلورة المنبعثة من هذه العصبونة عند طولي موجة إثارة مختلفين.

يتم تعديل معظم صبغات مؤشرات الكالسيوم بشكل إضافي للسماح لها بعبور الغشاء الخلوي بسهولة، ويتم إدخالها إما في محلول الحمام مع العصبونات أو حقنها في أنسجة الدماغ لدراسات الحيوان الكامل.

تمتلك بعض الصبغات خصائص إثارة مزدوجة أو انبعاث مزدوج اعتماداً على ما إذا كان الكالسيوم مرتبطاً أم لا. لنأخذ على سبيل المثال صبغة Fura-2، التي تمتلك طول موجة إثارة مختلف عندما يكون الكالسيوم مرتبطاً مقارنة بما يكون عليه عندما لا يكون مرتبطاً. ومن خلال حساب نسبة شدة الانبعاث عند طولي موجة الإثارة، يمكن الحصول على تقدير أكثر دقة لتركيز الكالسيوم.

تُسمى صبغات الإثارة أو الانبعاث المزدوج، مثل Fura-2، مؤشرات الكالسيوم النسبية (ratiometric calcium indicators). وتوجد صبغات غير نسبية لها أطوال موجية واحدة للإثارة والانبعاث، ومع ذلك، فهي أكثر عرضة للتبييض الضوئي، وهو ضعف أو فقدان الفلورة نتيجة التعرض الطويل للضوء.

تتمثل الخطوة الأساسية قبل استخدام الصبغة في التجربة في معايرة قياسات الفلورة المأخوذة من الصبغة باستخدام محاليل ذات تركيزات معروفة من الكالسيوم. سيتيح ذلك للعلماء تقدير تركيزات الكالسيوم داخل الخلايا بدقة بناءً على شدة الانبعاث المقاسة أثناء التجارب.

بعد أن تعلمنا كيفية عمل مؤشرات الكالسيوم، دعونا نستكشف كيفية تصوير تدفق الكالسيوم في الخلايا العصبية المزروعة في أطباق.

ابدأ بتحضير صبغة مؤشر الكالسيوم المختارة، مثل Fura-2، وخلطها مع المحاليل الفسيولوجية الإضافية. استخدم جهاز الـ Vortex للمحلول لضمان الخلط الجيد. وبمجرد خلطها بشكل كافٍ، انقلها إلى طبق. الآن، ضع شريحة الغطاء التي تحتوي على الخلايا العصبية المستزرعة في الطبق الذي يحتوي على محلول الصبغة. بعد ذلك، قم بحضن الخلايا العصبية في الظلام للمدة المطلوبة وفي درجة الحرارة المناسبة، والتي تكون في هذه الحالة 30 دقيقة عند 37 ˚C. بعد فترة الحضن، انقل شريحة الغطاء إلى طبق خالٍ من الصبغة.

الخطوة التالية هي تثبيت شريحة الغطاء على غرفة التصوير الخاصة بالمجهر. بمجرد التثبيت، قم بتوصيل خط الإدخال لنظام التروية واملأ الغرفة ببطء. ثبت الغرفة على منصة المجهر وقم بتركيب خطوط التروية المخرجة، مع ضمان التدفق المستمر عبر نظام التروية.

الآن وبعد أن أصبحت منصة المجهر جاهزة، قم بضبط تركيز الخلايا العصبية باستخدام الضوء المرئي. اختبر الصبغة عن طريق إضاءة الخلايا عند أطوال موجية تبلغ 340 و380 nm. تذكر أنه في حالة Fura-2، يجب أن تبعث الخلايا العصبية غير المنشطة ضوءاً أكثر عند استثارتها بطول موجي 380 nm لأن الكالسيوم غير مرتبط.

بعد ذلك، اضبط إعدادات الكاميرا من أجل تحسين المدى الديناميكي قبل بدء التجربة. التقط صورة عند كل طول موجي، ثم استخدم أداة منطقة الاهتمام أو ROI لقياس شدة الخلفية عند كل طول موجي. أدخل قيم الخلفية في برنامج التحكم حتى يمكن طرحها من الصور اللاحقة.

بمجرد اكتمال الإعداد الأولي، اختر خمسة مجالات رؤية تقريباً ليتم تصويرها في التجربة واحفظ الإحداثيات في برنامج التحكم. خلال التجربة، تتحرك المنصة الآلية إلى مجال ما، وتجمع نسبة شدة المجال عند أطوال موجية 340 و380 nm، ثم تنتقل إلى المجال التالي حتى يتم جمع كافة المجالات.

في بعض التجارب، يُضاف عامل دوائي إلى سائل التروية يتسبب في تغييرات في مستويات الكالسيوم داخل الخلايا. يمكن لمحلول البوتاسيوم عالي التركيز، الذي يؤدي إلى إزالة استقطاب الخلايا العصبية، أن يتسبب في ارتفاع تركيز الكالسيوم داخل الخلايا كما هو موضح في هذه السلسلة من الصور المسرعة، وهو يعمل كضابط إيجابي جيد. وبمجرد اكتمال جمع البيانات، انتقل إلى التحليل.

لتحليل النتائج، حدد مناطق الاهتمام التي تشمل الخلايا العصبية أو أجزاء منها باستخدام البرنامج. بعد ذلك، استخدم البرنامج لقياس معلومات شدة الصور النسبية من كلا الطولين الموجيين عند كل ROI في جميع الصور التي تم جمعها. وباستخدام هذه المعلومات، يمكن إجراء تقييم كمي للتغيرات في تركيزات الكالسيوم داخل الخلايا بمرور الوقت.

بعد أن اكتسبت فهماً لكيفية إجراء تصوير الكالسيوم في الخلايا العصبية، دعنا نلقي نظرة على بعض الطرق التي تُطبق بها هذه الطريقة القيمة في الأبحاث اليوم.

أولاً وقبل كل شيء، يُستخدم تصوير الكالسيوم لدراسة كيفية تقلب تدفق الكالسيوم داخل الخلايا فيما يتعلق بالنشاط العصبي.

في هذه الدراسة، تم ملء خلايا عصبية فردية بصبغة مؤشر الكالسيوم أثناء تسجيلها باستخدام تقنية تثبيت الرقعة (patch-clamp). ويوفر التحكم الدقيق في جهد الغشاء الذي تتيحه تقنية patch-clamp رؤية متعمقة لديناميكيات تدفق الكالسيوم.

يُمكّن تصوير الكالسيوم الباحثين من دراسة نشاط الشبكة المتزامن للغاية للخلايا العصبية.

هنا، استخدم علماء الأعصاب تصوير الكالسيوم لتقييم الإشارة الفلورية لـ 40 خلية عصبية. وباستخدام هذه المعلومات، يمكن تحديد خصائص الشبكة مثل انتشار الإشارة والارتباطات العصبية.

ويمكن لديناميكيات الكالسيوم أيضاً أن تكشف عن كيفية معالجة الخلايا العصبية للإشارات القادمة من العالم الخارجي، مثل الروائح.

في هذه التجربة، تم استزراع أعضاء استشعار الفيرومونات المستخرجة من أنف فأر في المزرعة. وتم تحضين الخلايا العصبية داخل النسيج باستخدام Fura-2 وتصويرها أثناء تعريضها لمواد عطرية مثل البول أو الفيرومونات النقية. ومن خلال التحكم في تعبير بروتينات مستقبلات الروائح في الخلايا العصبية الشمية، يمكن تصور كيف يؤثر بروتين واحد بشكل مباشر على قدرة الخلية على الاستجابة لروائح فريدة.

لقد شاهدتم للتو مقدمة JoVE حول تصوير الكالسيوم في العصبونات. ناقشنا في هذا المقطع الخصائص الكامنة وراء هذه التقنية واستعرضنا تجربة نموذجية.

ونظراً للأدوار الهامة والمتعددة للكالسيوم، سيظل تصوير الكالسيوم أداة حيوية في فهم العصبونات وكيفية تفاعلها مع بعضها البعض.

شكراً للمشاهدة!