الكمية المناعي الفحص لقياس التفاوت في مستويات البروتين في Centrosomes

الهدف العام من هذا الإجراء هو تحديد التغيرات النسبية في مستوى البروتين في الجسيمات المركزية في ظل ظروف مختلفة. على سبيل المثال ، في مرحلة معينة من دورة الخلية بعد تثبيط البروتيازوم ، يتم تحقيق ذلك عن طريق معالجة الخلايا التي تنمو على زلات الغطاء أولا إما بمثبط البروتيازوم MG one 15 أو باستخدام مذيب التحكم DMSO. ثم إضافة BRDU على الفور إلى كلتا الخليتين واحتضانهما لمدة أربع ساعات في حاضنة زراعة الخلايا.

الخطوة الثانية هي نقل زلات الغطاء إلى صفيحة 24 بئر لإصلاح الخلايا. بعد ذلك ، يتم تلطيخ الخلايا بالأجسام المضادة ضد BRDU والبروتينات ذات الأهمية ، ثم بالأجسام المضادة الثانوية المقابلة. تتمثل الخطوة الأخيرة في الحصول على صور للخلايا الإيجابية ل BRDU باستخدام المجهر الفلوري وبرنامج التصوير الرقمي لتطبيق وقت التعرض المتطابق وطول المحور Z على الخلايا من كل عينة.

ثم تحليل الصور لتحديد المستوى النسبي ل romal VDA C3. في النهاية ، يتم استخدام الفحص المجهري المناعي الكمي لإظهار أن التجمع الصومالي المركزي ل VDA C3 يزداد بمقدار الضعف عندما يتم تثبيط البروتيازوم أثناء المرحلة S. الميزة الرئيسية لهذه التقنية على الطرق الحالية مثل قياس التدفق الخلوي أو النشاف المناعي أو المجهر الكمي ، هي أن هذه التقنية تحلل المستوى الروماني النسبي للبروتين في عينتين معالجتين مختلفتين تتم معالجتهما على زلات غطاء مختلفة. تستخدم هذه الطريقة التطبيع وفقا لمعيار داخلي للتحكم في الحاجة إلى معالجة مجموعتي الخلايا التجريبيتين.

بشكل منفصل ، على الرغم من أن هذه الطريقة يمكن أن توفر نظرة ثاقبة لتنظيم بروتينات معينة في الجسيمات المركزية. يمكن تطبيقه أيضا على مواقف أخرى مثل الهياكل تحت الخلوية الأخرى أو فحص مجموعات معينة من البروتينات الموجودة في مواقع متعددة داخل الخلية. وسيتم توضيح الإجراء هو schu majumder, باحث ما بعد الدكتوراه من مختبري لبدء مرور التجربة مرتين 10 إلى الخامس RPE تنمو بشكل غير متزامن خلية واحدة في أطباق 35 ملم معدة مسبقا مع شفاه تغطي وتنمو الخلايا في ملليلتر من الوسط الكامل.

استبدل وسط الاستزراع كل 24 ساعة بوسط دافئ طازج بعد 44 ساعة. استبدل وسط الاستزراع بوسط كامل يحتوي على 0.05٪ DMSO أو MG one 15 بتركيز نهائي من خمسة ميكرومولار ، وفي نفس الوقت أضف BRDU إلى الخلايا بتركيز نهائي يبلغ 40 ميكرومولار تحتضن الخلايا لمدة أربع ساعات. بعد ذلك ، انقل كل زلة غطاء إلى صفيحة 24 بئر.

أضف 500 ميكرولتر من الميثانول المحروث مسبقا إلى كل بئر واحتضان اللوحة عند 20 درجة مئوية تحت الصفر لإصلاح الخلايا. بعد 10 دقائق ، اغسل الغطاء على الفور ثلاث مرات باستخدام 500 ميكرولتر من محلول الغسيل. احتضان الخلايا الثابتة على الغطاء ، ينزلق في 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت للحجب لمدة 30 دقيقة أثناء احتضان الخلايا.

قم بإعداد غرفة مرطبة عن طريق وضع منشفة ورقية مبللة في النصف السفلي من صندوق طرف ماصة فارغ سعة 1000 ميكرولتر. ضع شريطا من العطر على سطح الرف وأضف قطرة 20 ميكرولتر من الأرنب المضاد ل V DDA ثلاثة والجسم المضاد لتوبولين جاما المخفف في منع المخزن المؤقت على الطفيلي. بعد الحظر ، اقلب زلة غطاء على كل قطرة من محلول الأجسام المضادة.

تأكد من غمر الخلايا وأغلق غطاء صندوق الأطراف. احتضان الخلايا بالأجسام المضادة الأولية طوال الليل عند أربع درجات مئوية في الغرفة المرطبة. اقلب زلات الغطاء مرة أخرى وأعدها إلى 24.

اغسل جيدا زلات الغطاء ، ثم احتضنها في محلول 150 ميكرولتر من الأجسام المضادة الثانوية ، مخففة في مانع المخزن المؤقت لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة بعد الحضانة ، اغسل زلات الغطاء ثلاث مرات باستخدام عازلة الغسيل. قم بإصلاح RPE الملطخة بخلية واحدة ب 500 ميكرولتر من الميثانول المبرد عند 20 درجة مئوية تحت الصفر. بعد تثبيت الخلايا لمدة 10 دقائق ، اغسلها ثلاث مرات في محلول الغسيل.

بعد ذلك ، احتضان الخلايا في 200 ميكرولتر من اثنين من حمض الهيدروكلوريك العادي لمدة 30 دقيقة. في درجة حرارة الغرفة ، قم بتحييد الخلايا ب 300 ميكرولتر من درجة الحموضة ثلاثية CL ثمانية ، واغسل الخلايا ثلاث مرات. مع المخزن المؤقت للغسيل ، قم بسد الخلايا ب 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت للحجب لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.

بعد الحظر ، احتضان الخلايا بجسم مضاد للفئران المضاد ل BRDU ومنع المخزن المؤقت لمدة 45 دقيقة عند 37 درجة مئوية في الغرفة المرطبة. أعد الغطاء ينزلق مرة أخرى إلى 24. طبق جيد وغسل الخلايا.

بعد ذلك ، احتضنها بجسم مضاد ثانوي مخفف في 150 ميكرولتر من المخزن المؤقت المانع. في طبق 24 جيدا لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. ثم اغسل زلات الغطاء ثلاث مرات باستخدام بقعة XPBS واحدة ، وهي قطرة سعة ستة ميكرولتر من محلول تركيب يحتوي على كاشف Antifa على مجهر زجاجي.

حرك انزلاق غطاء مقلوب بحيث يكون جانب الخلية متجها لأسفل على محلول التثبيت. باستخدام منديل تنظيف ناعم ، اضغط برفق على زلة الغطاء على الشريحة لإزالة السائل الزائد ، وأغلق الغطاء على المجهر. انزلق عن طريق وضع طلاء الأظافر على طول حافة زلة الغطاء.

استخدم هدف غمر زيت APO بخطة 100 × بفتحة عددية 1.4 للحصول على صور خلية RPE موجبة BRDU في درجة حرارة الغرفة. حدد المستوى البؤري العلوي والسفلي المناسب على طول المحور Z بحجم الخطوة 0.2 ميكرون ، واحصل على صور على طول المحور Z. بعد ذلك ، قم بإجراء فك الالتفاف لجميع مكدسات الصور المكتسبة على طول المحور Z.

احصل على الإسقاط الكلي للكثافة لكل صورة. قم بالتكديس على طول المحور Z للخلايا التي يتم فصل الجسيمات المركزية فيها بأقل من ميكرون. ارسم مربعا صغيرا من 20 إلى 30 بكسل لكل جانب حول كلا الجسيمات المركزية وحدد المنطقة المحددة.

ارسم مربعا أكبر من 24 إلى 35 بكسل لكل ضلع حول المربع الأول وحدد المساحة المحددة للمربع الكبير. ثم احصل على المساحة وكثافة التألق الإجمالية لكل فلورو أربعة. في كل مربع ، احسب شدة التألق المصححة في الخلفية لكل فلورو. أربعة.

أخيرا ، احصل على شدة التألق الطبيعي ل VDA C3 عن طريق حساب نسبة شدة التألق المصححة في الخلفية للفلورو. تم التقاط أربعة إلى تلك الموجودة في الفلورو الأربعة المستخدمة للصور القياسية الداخلية المختارة من حقول عشوائية من RPE المتنامي بشكل غير متزامن خلية واحدة محتضنة مع BRDU وإما مثبط البروتيازوم MG واحد 15 أو مذيب التحكم DMSO وعرض الحمض النووي و BRDU. صححت الخلفية شدة التألق المقابلة ل Centro Somal.

كان VD three أعلى بمقدار 2.5 مرة تقريبا في MG واحد 15 خلية معالجة ثم في خلايا التحكم كما هو موضح في هذا المربع ومخطط الشعيرات. عندما تم تطبيع البيانات لإجمالي VD ثلاثة مضان مقابل توبولين جاما ، زادت الطية ، وانخفضت قليلا إلى ضعفين تقريبا. لم يتأثر تلطيخ VD C3 في الخلايا غير الرومانية أو المستوى الخلوي الكلي ل VD three بتثبيط البروتيازوم.

وبالتالي ، يتم تنظيم التجمع الروماني ل VDA C3 عن طريق التحلل بوساطة البروتيازوم. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر أنه يجب رفع الأجسام المضادة ضد بروتين الاختبار والمعيار الداخلي في أنواع مضيفة مختلفة وأنه يجب الحصول على صور كلتا العينتين باستخدام معلمات تصوير متطابقة ، مثل عدد الولادات القيصرية وأوقات التعرض من أجل تقليل تأثير التصوير الرقمي.