Quantitative Immunofluorescence Assay to Measure the Variation in Protein Levels at Centrosomes

Shubhra Majumder; Harold A. Fisk

doi:10.3791/52030

الكمية المناعي الفحص لقياس التفاوت في مستويات البروتين في Centrosomes

JoVE Journal
Biology

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

JoVE Journal Biology

Quantitative Immunofluorescence Assay to Measure the Variation in Protein Levels at Centrosomes

الكمية المناعي الفحص لقياس التفاوت في مستويات البروتين في Centrosomes

Full Text

15,801 Views

09:39 min

December 20, 2014

DOI: 10.3791/52030-v

Shubhra Majumder¹, Harold A. Fisk¹

¹Department of Molecular Genetics,The Ohio State University

Please note that some of the translations on this page are AI generated. Click here for the English version.

هنا ، تم تطوير اختبار مضان كمي جديد لقياس التغيرات في مستوى البروتين على وجه التحديد في الجسيمات المركزية عن طريق تطبيع شدة مضان هذا البروتين إلى معيار داخلي مناسب.

الهدف العام من هذا الإجراء هو تحديد التغيرات النسبية في مستوى البروتين في الجسيمات المركزية في ظل ظروف مختلفة. على سبيل المثال ، في مرحلة معينة من دورة الخلية بعد تثبيط البروتيازوم ، يتم تحقيق ذلك عن طريق معالجة الخلايا التي تنمو على زلات الغطاء أولا إما بمثبط البروتيازوم MG one 15 أو باستخدام مذيب التحكم DMSO. ثم إضافة BRDU على الفور إلى كلتا الخليتين واحتضانهما لمدة أربع ساعات في حاضنة زراعة الخلايا.

الخطوة الثانية هي نقل زلات الغطاء إلى صفيحة 24 بئر لإصلاح الخلايا. بعد ذلك ، يتم تلطيخ الخلايا بالأجسام المضادة ضد BRDU والبروتينات ذات الأهمية ، ثم بالأجسام المضادة الثانوية المقابلة. تتمثل الخطوة الأخيرة في الحصول على صور للخلايا الإيجابية ل BRDU باستخدام المجهر الفلوري وبرنامج التصوير الرقمي لتطبيق وقت التعرض المتطابق وطول المحور Z على الخلايا من كل عينة.

View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos