جيل من المستحثة متعددة القدرات الخلايا الجذعية من الضمور العضلي المرضى: كفاءة خالية من التكامل إعادة برمجة الخلايا المستمدة البول

الهدف العام من التجربة التالية هو توليد الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات أو IPSC بكفاءة من مرضى الحثل العضلي بدءا من مزارع الخلايا المشتقة من البول وطريقة إعادة البرمجة الخالية من التكامل. يتم تحقيق ذلك عن طريق جمع عينات البول أولا من مرضى ضمور العضلات. كخطوة ثانية ، يتم عزل خلايا البول وتوسيعها إلى مزارع الخلايا المشتقة من البول.

بعد ذلك ، يتم نقل الخلايا المشتقة من البول بفيروس سينداي الذي يحتوي على عوامل ياماناكا وتظهر المستعمرات النموذجية متعددة القدرات بعد 12 يوما. في النهاية من خلال المقطع 13 ، يمكن تأكيد الحالة الحرة للجينات المعدلة وراثيا للخلايا الجذعية متعددة القدرات عن طريق تحليل R-T-P-C-R. الميزة الرئيسية لهذه التقنية على الطرق الحالية مثل إعادة برمجة الخلايا الليفية الجلدية المعزولة باستخدام نواقل الفيروسات العدسية هي أنه باستخدام هذه التقنية ، يمكن الحصول على الخلايا الجسدية بشكل غير جراحي من المرضى واستخدامها لتوليد IPCs بكفاءة باستخدام طريقة البصمة الصفرية لإعادة البرمجة الفيروسية.

يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال الحثل العضلي ، مثل كيفية نمذجة هذه الحالات في المختبر دون مخاوف تتعلق بالسلامة للتطبيق البشري. وسيتم توضيح الإجراءات من قبل محمد زيشان آل ، زميل ما بعد الدكتوراه كورتني جيستينغ ، وهو فني ، وميلاني رايدر ، وطالبة دراسات عليا في ميلاني رايدر ، وجميعهم من مختبري لجمع عينة بول ، ابدأ بتقديم المشورة للمريض بشرب السوائل قبل 30 دقيقة من الجمع لضمان إمكانية جمع حوالي 30 إلى 40 مل من البول. عندما يكون المريض جاهزا ، أعط المريض مجموعة أدوات جمع البول تحتوي على العناصر التالية ، وتعليمات مكتوبة حول كيفية الحصول على مراحيض معقمة أو نظيفة وأخذ عينات من المراحيض الرطبة المضادة للبكتيريا ، وكوب جمع عينات معقمة سعة 100 مل.

عندما يتم جمع العينة ، ضع كوب التجميع على الفور على الجليد وانقل العينة إلى المختبر في مبرد. ثم استخدم ماصات معقمة لنقل عينة البول إلى أنابيب طرد مركزي معقمة سعة 50 مل، وقم بتدوير الأنابيب عند 400 مرة جم لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك ، في خزانة السلامة البيولوجية BSL ، استنشق كل خزانة باستثناء الأخيرة ، المليلتر من المادة الطافية ، مع الحرص على عدم إزعاج الحبيبات.

ثم اغسل الخلايا في سبعة ملليلتر من محلول الغسيل وقم بتدوير الخلايا مرة أخرى. هذه المرة ، استنشاق كل ما عدا الأخير حوالي 0.2 إلى 0.5 مل من المادة الطافية. الآن أعد استخدام الحبيبات في ملليلترات إلى ثلاثة ملليلتر من الخلية السلفية البولية أو وسط UPC وانقل المعلق إلى أربعة إلى ستة آبار من صفيحة 24 بئر غير مطلية بعد 72 ساعة ، واستكمل الثقافة ب 0.5 مل من وسط UPC الطازج لكل بئر.

راقب المزرعة لمدة تتراوح بين أربعة إلى ستة أيام من الحضانة. يجب أن تبدأ مستعمرات صغيرة من خلية إلى أربع خلايا من الخلايا المستديرة أو الممدودة التي تمثل الخلايا الظهارية الكلوية من النوع الأول أو النوع الثاني على التوالي في الظهور. استمر في تغيير الوسيط كل يومين إلى ثلاثة أيام.

نظرا لأن المستعمرات ستخضع لمرحلة توسع سريعة في حوالي تسعة إلى 15 يوما من الثقافة ، يجب أن تكون الخلايا ملتقية بنسبة 80 إلى 90٪ في هذه المرحلة ، وتقسم الخلايا إلى بئرين إلى أربعة بئر من صفيحة 24 بئرا لمزيد من التوسع. بتمييز هذه الثقافة على أنها ممر خلوي واحد ، يمكن بعد ذلك تمييز خلايا البول لعلامات محددة للنسب من خلال تحليل قياس التدفق الخلوي ، أو التلوين الكيميائي المناعي ، أو من خلال تفاعل البوليميراز المتسلسل للنسخ العكسي لضمان إعادة برمجة عالية الكفاءة لأيام ما قبل بذرة التحويل ، 60،000 خلية لكل بئر. من ممر واحد إلى خمسة ثقافة إلى بئرين من ستة صفيحة آبار في اليوم صفر.

قم بإعداد ناقل إعادة برمجة Sendai عن طريق إضافة كل عامل من عوامل OSKM الأربعة في MLI مناسب لإعادة البرمجة إلى مليلتر واحد من وسائط UPC الدافئة ، واستنشاق وسائط التشويق وإضافة تعليق الفيروس ببطء إلى بئر واحد من خلايا البول خلال الأيام الستة القادمة. استبدل المادة الطافية يوميا بوسط UPC الطازج في اليوم الخامس من أطباق بذور الميتومايسين المعالجة MES على أطباق الاستزراع المغلفة بالجيلاتين 100 ملم مربع في اليوم السادس. قم بفصل خلايا البول عن التربسين ، وأعد تعليقها في وسط UPC وقم بوضعها في خمسة أضعاف 10 من الرابع إلى مرتين في 10 من الخلايا الخامسة لكل لوحة تغذية الميثامفيتامين.

في اليوم التالي ، استبدل وسط UPC بالمرحلة الجنينية البشرية أو وسط HES وراقب الخلايا تحت المجهر لمراقبة الخلايا المحولة حوالي 12 إلى 18 يوما. بعد التنبيغ ، يجب أن تشكل الخلايا مجاميع نسيلة ذات مورفولوجيا مرصوفة بالحصى ونسبة نواة أعلى إلى السيتوبلازم. لتحديد استنساخ IPSC المعاد برمجته ، قم بإجراء تلطيخ الخلايا الحية لجسم مضاد TRA 180 1.

ثم استخدم إبرة قياس 26 نصف بوصة لفصل المجاميع النسيلي الموجب TRA 180 1 إلى أربع إلى ست قطع صغيرة متساوية الحجم لكل استنساخ. بعد ذلك ، استخدم طرف ماصة معقم لالتقاط ونقل 10 إلى 20 قطعة متقاطعة من نسخ متعددة إلى كل بئر صفيحة مطلية ب 24 بئر مع HESC. متوسط ، بعد 24 إلى 48 ساعة من طلاء المستنسخة المعاد برمجتها على سطح matrigel.

استبدل الوسيط بوسيط IPSC. استخدم طرف ماصة لكشط أي خلايا متمايزة يدويا أو خلايا تغذية الميثامفيتامين الملوثة للمساعدة في تنقية استنساخ IPSC الضمور المعاد برمجته بالكامل ومتعددة القدرات. بعد أن يصل حجم المستنسخة إلى حوالي 100 ميكرومتر ، قم بفصل الخلايا ب EDTA لمدة ثلاث دقائق ، ثم قم بلوحة مجاميع الخلايا الصغيرة من IPSC الضمور المعاد برمجته ، معلقة في وسط IPSC مكمل بمثبط RO kinase على لوحة 12 رقائق مطلية ب matrigel طازجة.

أخيرا ، تأكد من تعدد القدرات لكل استنساخ عن طريق تحليل التعبير الجيني والتلوين الكيميائي المناعي. بالنسبة للعلامات متعددة القدرات ، تكون معظم الخلايا المعزولة من بول الإنسان إيجابية لعلامات السلف والخلايا الجذعية مثل CD 44 و CD 73 و CD 1 46. تظهر الخلايا أيضا علامات اللحمة المتوسطة مثل ألفا العضلات الملساء أكتين ومينتون.

يوفر R-T-P-C-R للخلايا المعزولة دليلا على وجود مجموعة مختلطة من الخلايا في الثقافات. في ذلك هناك تعبير ضعيف عن السيتوكيراتين سبعة و UIN واحد A وثلاثة علامات من الخلايا الظهارية الأوروبية. تتحول خلايا البول من خلايا ممدودة من النوع الثاني في اليوم صفر إلى نمط مرصوف بالحصى بحلول اليوم الرابع من إعادة البرمجة.

بحلول اليوم 12 ، لوحظت المستنسخة النموذجية متعددة القدرات وتكون قادرة على الحفاظ على مورفولوجيتها متعددة القدرات في ظل ظروف خالية من المغذية. يمكن استخدام تلطيخ الخلايا الحية ل TRA 180 1 لتحديد المستنسخة المعاد برمجتها. لتأكيد توليد المستنسخة المتجهة والجينات المعدلة وراثيا ، يمكن إجراء R-T-P-C-R باستخدام بادئات ضد جينوم فيروس سينداي وكل عامل من عوامل OSKM الخارجية.

لم يعد يتم اكتشاف التعبير الجيني الخارجي عن طريق المقطع 13 ، ولكن يمكن ملاحظة تنظيم العوامل الداخلية. يؤكد تلطيخ الفلورسنت المناعي التعبير عن العلامات متعددة القدرات على IPCs ولكن ليس على خلايا البول. يمكن بعد ذلك التحقق من التعبير عن بروتين الديستروفين والجين عن طريق المزيد من تلطيخ الفلورسنت المناعي والنشاف الغربي و R-T-P-C-R على التوالي كما هو موضح في هذه الصور التمثيلية من النوع البري للتحكم وخطوط الخلايا الضمورية.

بمجرد إتقان ، يمكن استخدام هذه التقنية لتحقيق إعادة برمجة مجانية ل ucs. في غضون أسابيع قليلة بعد هذا الإجراء ، يمكننا تمييز IPCs إلى خلايا عضلية قلبية أو خلايا عضلية هيكلية من أجل تعزيز الآليات الكامنة وراء ضمور العضلات.