متعددة الفوتون بين الخلايا التصوير الصوديوم جنبا إلى جنب مع بوساطة الأشعة فوق البنفسجية Uncaging البؤري من الغلوتامات في الخلايا العصبية الهرمية CA1

الهدف العام من هذا الإجراء هو استحضار وتحليل ديناميكيات الصوديوم في الأجزاء الخلوية الصغيرة ، مثل العمود الفقري والتشعبات في الخلايا العصبية المركزية في الأنسجة السليمة. يتم تحقيق ذلك عن طريق تحضير شريحة الحصين الحادة للفأر أولا ، وتحميل خلية عصبية هرمية بصبغة الفلورسنت الحساسة للصوديوم SBFI من خلال ماصة التصحيح ، وتصور التشكل الخلوي باستخدام إثارة الفوتون المتعدد. الخطوات التالية هي اختيار تغصنات شوكية للتجربة وحقن فولي مركب منشط بالصور مثل الغلوتامات المحبوسة في قفص بالقرب من هذا التغصن.

ثم يتم تطبيق وميض الأشعة فوق البنفسجية على الغلوتامات غير المجمعة من فولي باستخدام ليزر الأشعة فوق البنفسجية الذي تم وضعه بدقة لاستهداف حجم صغير قريب من التغصنات المختارة. الخطوة الأخيرة هي مراقبة التغييرات الناتجة في مضان SBFI في التغصنات ، ومراقبة التغيرات الناتجة في الصوديوم في العمود الفقري المجاور. كما يتم تسجيل تيارات الغشاء المصاحبة.

في نهاية المطاف ، سيمكن استخدام الأدوات الدوائية المناسبة مثل حاصرات المستقبلات من دراسة الآليات التي تولد إشارات الصوديوم داخل الخلايا المستحثة. توفر هذه الطريقة أداة موثوقة للتحقيق في إشارات الصوديوم داخل الخلايا في المقصورات الخلوية الصغيرة وفي أنسجة المخ السليمة. هنا نجمع بين مشبك رقعة الخلية بالكامل وتصوير الصوديوم متعدد الفوتون مع إجراء معدل لفك الإزالة الناجم عن الأشعة فوق البنفسجية.

مع يسمح لنا بمراقبة الاستجابات الخلوية بناء على التطبيقات الدقيقة والبؤرية للمركبات العصبية. سيتم عرض الإجراء من قبل Karl KA و Kaan Kleinhans ، طالب الدراسات العليا في مختبري. لبدء تشريح الأنسجة ، ضع الدماغ على الفور في طبق بتري مع تشريح مثلج بارد ، أو سائل دماغي اصطناعي ، أو السائل النخاعي النخاعي وقم بتشريح نصف الكرة الأرضية عن طريق إجراء قطع سهمي على طول خط الوسط.

قم بإجراء قطع ثان في الاتجاه المطلوب كسطح حجب ثم نعلق هذا على مرحلة القطع من الاهتزاز مع الغراء الفائق. بعد إخراج غرفة القطع وعنصر التبريد في الاهتزاز من الفريزر ، ضع مرحلة القطع مع قسم الدماغ في الغرفة.

ثم ضع عنصر التبريد في الغرفة واغمر الأنسجة في تشريح مثلج بارد A CSF. بعد ذلك قطع 250 ميكرومتر سميكة. شرائح شبه سهمية من الحصين مع فيوم.

تأكد من أن سوائل CS تتدفق في جميع الأوقات. بعد التقطيع ، احتفظ بالأنسجة على شبكة في دورق بالسائل الدماغي النخاعي العادي واحتضنه عند 34 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. بعد الحضانة ، احتفظ بالأنسجة في درجة حرارة الغرفة.

يجب إجراء هذه التجربة في بيئة مظلمة ، ولكن يتم عرضها هنا في ظروف الإضاءة الخافتة لأغراض التصوير. لإعداد الأجهزة أولا ، قم بتشغيل مكونات نظام الفوتونات المتعددة واضبط محاذاة شعاع الليزر بالأشعة تحت الحمراء كما هو موضح في بروتوكول النص. ثم اضبط الطول الموجي لليزر متعدد الفوتون وشدة الشعاع عن طريق تغيير إعدادات الخلية PCAL ومضاعفات الصورة.

بعد ذلك ، قم بتشغيل ومعايرة نظام فك الفصل عن طريق وضع شريحة عينة الفلورسنت أسفل العدسة الموضوعية. ابدأ روتين المعايرة لبرنامج التحكم في وحدة فك القطع. اضبط ليزر الأشعة فوق البنفسجية على عدة نقاط ضمن نطاق المسح الخاص به أثناء التقاط التألق بكاميرا CCD بالنقر فوق بقعة ليزر الأشعة فوق البنفسجية.

في كل نقطة ، اضبط موضع مرايا المسح الجلفاني لتتوافق مع إحداثيات معينة في البرنامج. يتم تحقيق تحديد المواقع بدقة لبقعة فك الإزالة عن طريق استيراد صورة لنظام التصوير عبر اتصال شبكة بين أجهزة الكمبيوتر غير القابلة للفك والتصوير. باستخدام برنامج ملتقط الشاشة ، قم بقراءة إطارات برنامج التصوير باستمرار وضبط التصوير.

وفي إطارات القفص الجاهزة ، قم بتصدير كل إطار 10 بشكل متطابق من برنامج التصوير كصورة مرجعية إلى وحدة الفلاش لضمان الضبط المناسب أثناء التجربة بأكملها. بعد ذلك ، قم بتشغيل مكونات الفيزيولوجيا الكهربية للمعالجات الدقيقة وجهاز تطبيق الضغط لتوصيل المركب المحبوس إلى المنطقة المستهدفة. اسحب الماصات لمشبك رقعة الخلية بالكامل والوفرة المحلية باستخدام الشعيرات الدموية الزجاجية المصقولة بالنار.

ثم ضع الشريحة في الحمام التجريبي ولتثبيتها بشبكة ، ضع الحمام في مرحلة المجهر وقم ببث الشريحة بشكل دائم باستخدام السائل الدماغي النخاعي. ابدأ لقط رقعة الخلية بالكامل عن طريق تحميل ماصة التصحيح بمحلول داخل الخلايا أو ICS يحتوي على SBFI ثم قم بتحميل ماصة التروية المحلية بمركب محبوس. قم بتوصيل الماصات بأجهزة المعالجة الدقيقة المقابلة وضع القطب المرجعي في الحمام.

اختر خلية هرمية CA واحدة مع سوما تقع على عمق 30 إلى 70 ميكرومتر تحت سطح الشريحة لضمان مورفولوجيا الخلية السليمة بالإضافة إلى التشتت المنخفض والتوهين للحزمة غير المتساقطة. اقترب من هذه الخلية باستخدام ماصة رقعة تستخدم الفحص المجهري بالفيديو IR DIC. ضع شفطا لطيفا حتى يتم الحصول على ختم جيجا.

تعويض عن السعة السريعة. ثم كسر الغشاء وافتح الخلية للحصول على تكوين الخلية. أخيرا ، قم بتقييم جدوى الخلية في وضع المشبك الحالي.

حقن تيار إزالة الاستقطاب والتحقق من نشاط الارتفاع الناتج لإجراء التصوير والتحفيز. أولا ، أضف tetro DOIND إلى السائل الدماغي النخاعي لمنع تنشيط قنوات الصوديوم ذات الجهد المسور وتوليد إمكانات العمل. تصور التشكل الخلوي باستخدام إثارة الفوتون المتعدد وتألق SBFI الناتج.

اختر تغصنارا شوكيا للتجربة. قم بتكبير الصور بدقة أعلى وضع صندوق قصاصة حول التغصن. ثم ضع الماصة مع المركب المحبوس بالقرب من التغصنات.

ضع الماصة للسماح بالتروية المحلية الفعالة للتغصنات المختارة. اضبط الليزر غير القابل للفك لوضع بقعة فك الإزالة بالقرب من الهيكل محل الاهتمام. بعد ذلك ، قم بتعيين مناطق الاهتمام على التغصنات المختارة والعمود الفقري المجاور باستخدام برنامج التصوير.

اقترب من منطقة الاهتمام وقم بحقن المركب المحبوس لعدة ثوان مع تصحيح بدء الضغط المنخفض ، وتسجيلات المشبك والمضان عبر إشارة الزناد. أثناء الوفرة المحلية للمركب المحبوس ، يتم تعتيم شعاع الإثارة تماما لمنع التبييض. بعد ذلك ، أوقف الوفرة المحلية للمجمع المحبوس.

ثم قم بزيادة شدة ليزري الفوتون لتمكين الإثارة الفعالة ل SBFI وتطبيق فلاش الأشعة فوق البنفسجية للتهيئة على تغييرات شاشة القفص في مضان SBFI بالإضافة إلى المضي في التيار الجسدي لإيقاف التسجيل بعد استعادة مضان SBFI مرة أخرى إلى خط الأساس. للحصول على التشكل ، قم بتسجيل مكدس XY ، Z لمنطقة صندوق القصاصة المحددة للقياسات التي تم إجراؤها. تأكد من أن هذه المكدس قد تم أخذ عينات أكثر من الناحية المكانية لتمكين فك الالتفاف الأمثل للصورة وزيادة جودة الصورة ودقتها.

مكن تحميل الخلايا العصبية باستخدام SBFI من خلال ماصة التصحيح من تصور الخلية بأكملها ، بما في ذلك التشعبات الدقيقة والأشواك المجاورة من خلال استخدام إثارة الفوتونات المتعددة بعد التروية الموضعية مع الغلوتامات المحبوسة. أدى تطبيق وميض الأشعة فوق البنفسجية بالقرب من التغصنات إلى انخفاض عابر في انبعاث الفلورسنت من SBFI مما يعكس زيادة في تركيز الصوديوم داخل الخلايا. في الوقت نفسه ، تم تسجيل تيار داخلي في تطبيق SOMA لومض الأشعة فوق البنفسجية على الشرائح ، والتي لم يتم إغراقها مسبقا بالغلوتامات في قفص.

لم تثير أبدا تغييرات في مضان SBFI أو التيارات الداخلية مما يشير إلى أن هذه الإشارات ناتجة عن فك الغلوتامات. كانت سعة الذروة أعلى قليلا في العمود الفقري القريب من البقعة غير المنكوبة ، في حين أن أنماط الأشواك الإضافية تشبه التغصنات الأصلية. تمت دراسة مسار تدفق الصوديوم إلى التشعبات والعمود الفقري استجابة لفك الغلوتامات باستخدام حاصرات انتقائية لمستقبلات الغلوتامات المؤينة القابلة للنفاذ للصوديوم ، وإشارات الصوديوم داخل الخلايا التي يسببها الغلوتامات ، وتم حذف التيارات الجسدية المستحثة في وجود هذه الحاصرات.

عند غسل الحاصرات ، يتم استعادة الإشارات ، مما يدل على أن فك الغلوتامات ينشط مستقبلات الغلوتامات المتغيرات الخلوية على الخلايا العصبية الهرمية الكبيلة واحدة مما يؤدي إلى تيارات عابرة للصوديوم داخل الخلايا وتيارات داخلية. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر اختيار أقل كثافة ممكنة لليزر بالأشعة تحت الحمراء لتقليل أي ضرر يلحق بالمستحضر. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد للخطوات الحاسمة لنهجنا التجريبي لدراسة إشارات الصوديوم في البقايا الدقيقة الخلوية بمجرد إتقانها ، تتيح هذه التقنية تصويرا عالي الدقة للنشاط الذي يثير إشارات الأيونات داخل الخلايا في الأنسجة السليمة ، والتي تكون خالية من القطع الأثرية الحركية كما أدخلتها التقنيات الأخرى.